林穎，倪樂藝，余河杰，胡婷婷，蔡振寨，林李淼

1.臺州市第一人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 臺州 318020；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325088；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325015

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是最常見的實體瘤之一。根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計報告，肺癌和乳腺癌是最常見的癌癥（11.6%），其次是CRC（10.2%），而病死率最高的癌癥是肺癌（18.4%）、CRC（9.2%）和胃癌（8.2%）[1]。WHO估計，到2030年，新診斷的CRC病例和與CRC相關(guān)的死亡人數(shù)將分別增加到77%和80%[2]。目前，手術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療被認(rèn)為是CRC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而，不良反應(yīng)和耐藥性限制了CRC患者化療的使用[3-4]。癌基因的激活或抑癌基因的失活引發(fā)或加速惡性腫瘤的進(jìn)程[5]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，CRC的靶向藥物治療越來越受到研究者的關(guān)注[6-7]。然而，到目前為止，尚未在CRC中發(fā)現(xiàn)成熟、明確的分子機制或預(yù)后指標(biāo)。

K12基因位于染色體17q25上CD7基因上游，經(jīng)人類基因圖譜研討會（Human Gene Mapping Workshops, HGMW）批準(zhǔn)命名為分泌型跨膜蛋白1（secreted and transmembrane 1, SECTM1）[8-10]。該基因全長14 kb，編碼在外周血白細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞系中檢測到的最顯著的1.8 kb mRNA[10]。轉(zhuǎn)染SECTM1基因的細(xì)胞表面可以檢測到SECTM1，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)[10-11]。SECTM1是一種廣泛表達(dá)的INF誘導(dǎo)分子，作為T細(xì)胞激活的有效共刺激配體，與抗CD28抗體協(xié)同作用[12]。例如，SECTM1可作為T細(xì)胞的共刺激因子，受干擾素α（interferon-α,IFN-α）和IFN-γ的調(diào)控，在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)[12]。SECTM1也與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，在乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞系和部分髓系白血病細(xì)胞中高表達(dá)[10-12]。然而，SECTM1表達(dá)在CRC中的生物學(xué)意義尚不清楚。本研究擬分析SECTM1表達(dá)與CRC的相關(guān)性以及SECTM1的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料和儀器：CEA-RIA試劑盒購自上海起發(fā)實驗試劑有限公司；抗SECTM1抗體（AB106377）購自美國Abcam公司；山羊抗兔IgG、3，5-二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）購自北京中山生物有限公司；6種人CRC細(xì)胞系（HCT116、RKO、Caco-2、HT-29、DLD-1和HCT-8）和正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞系（NCM460）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher Scientific公司；10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Atlanta Biologicals Lawrenceville公司；GV367慢病毒載體購自上海吉凱基因化工科技有限公司；特異性慢病毒和陰性對照（negative control, NC）慢病毒包裝質(zhì)粒購自上海捷恩生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；TRIzol購自上海普菲生物科技有限公司；Promega M-MLV試劑盒購自北京普羅梅加生物有限公司；SYBR Master Mixture購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；qRTPCR儀購自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；Western blot曝光儀購自廣州博鷺騰生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀分析購自北京安諾倫生物科技有限公司。

1.1.2 臨床資料：收集2011年至2017年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院370份CRC和癌旁組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：均接受手術(shù)，經(jīng)活檢及病理診斷CRC。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受化療和放療或患有其他相關(guān)腫瘤的患者。腫瘤分期按照美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)盟（2016）共同發(fā)布的腫瘤TNM分期第8版。組織學(xué)分級由2名病理科醫(yī)師分別根據(jù)WHO分級標(biāo)準(zhǔn)確定。CEA水平采用放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）測定，使用CEA-RIA試劑盒。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（LCKY2019-223）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)分析：采用免疫組織化學(xué)檢測CRC及癌旁組織中SECTM1的表達(dá)。將石蠟包埋切片在二甲苯中脫蠟，并在乙醇溶液中水化。切片在室溫下用過氧化氫浸泡，清水沖洗后，浸入枸櫞酸鹽緩沖液中，然后在正常山羊血清中浸泡30 min。最后，將切片與抗SECTM1抗體（稀釋1∶20 000）在濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，然后加入山羊抗兔IgG在室溫下培養(yǎng)30 min。使用3，5-DAB進(jìn)行檢測，并用蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染。2名病理科醫(yī)師獨立分析結(jié)果。如果結(jié)果不一致，則使用雙頭顯微鏡重新評估，以獲得最終結(jié)果。SECTM1蛋白表達(dá)的組織化學(xué)評估包括染色強度（無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分）和陽性細(xì)胞百分比（＜5%陽性CRC細(xì)胞為0分，5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分）。將染色強度和百分比評分相加，0～3分為陰性表達(dá)，4～7分為陽性表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系構(gòu)建：選取6種人CRC細(xì)胞系（HCT116、RKO、Caco-2、HT-29、DLD-1和HCT-8）和正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞系（NCM460），均接種于RPMI1640和FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用AgeI/NheI酶切SECTM1序列（NM_003004），并克隆到GV367慢病毒載體中感染HCT116 CRC細(xì)胞系。將HCT116細(xì)胞系分2組，第1組為SECTM1過表達(dá)（overexpression,OE）組（OE組），第2組未處理為正常對照組（NC組）。根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000將siRNA-SECTM1（CACCAGAGAAATAACAGACAA）和siRNANC（TTCTCCGAACGTGTCACGT）轉(zhuǎn)染DLD-1細(xì)胞系。將DLD-1細(xì)胞系分3組，其中敲除組（knocked down，KD）分為2組分別為KD1組和KD2組，1組為NC組。熒光顯微鏡（Olympus-BX53）用于確認(rèn)是否轉(zhuǎn)染了靶細(xì)胞，確保感染率約80%。

1.2.3 qRT-PCR：根據(jù)試劑盒的說明，使用TRIzol從CRC細(xì)胞系中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。GAPDH作為內(nèi)參。SECTM1目的基因序列引物為5’-GTC ACTGCTGTCTTCATCCTCT-3’和5’-GACCTTCATCTGGGGTTC TAG-3’，擴(kuò)增片段大小為117 bp。采用SYBR Master Mixture和qRT-PCR儀進(jìn)行實時定量PCR。相對轉(zhuǎn)錄水平通過2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western blot實驗：從細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。蛋白質(zhì)樣品加到凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗4 ℃孵育過夜。洗去多余一抗后，將PVDF膜浸泡于HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）中，37 ℃搖床孵育2 h。洗去二抗后顯色曝光。

1.2.5 細(xì)胞增殖實驗：細(xì)胞培養(yǎng)1～5 d，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）讀板儀測定450 nm處的吸光度，以反映細(xì)胞增殖情況。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實驗：用胰酶消化并收集細(xì)胞。在黑暗中加入10 μL膜聯(lián)蛋白V-APC。在測試前5 min加入碘化丙啶（propidium iodide, PI）。采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。膜聯(lián)蛋白V-APC陽性細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。

1.2.7 細(xì)胞周期實驗：用胰酶消化并收集細(xì)胞。處理后，將細(xì)胞固定在4 ℃預(yù)冷的乙醇中至少1 h。加入一定體積的細(xì)胞染色液和RNA酶。采用流式細(xì)胞儀檢測PI濃度，反映各期細(xì)胞的DNA分布情況，并計算各期細(xì)胞的百分比。

1.2.8 侵襲小室實驗：在內(nèi)室和外室之間覆蓋基底膜。將面向內(nèi)室的基底膜置于外室，向外室添加趨化劑。在趨化劑的誘導(dǎo)下，細(xì)胞開始穿透基底膜。培養(yǎng)48 h后，用棉簽去除小室的非侵入性細(xì)胞，在膜的下表面滴入2～3滴Giemsa染色液染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞并固定3～5 min。將細(xì)胞浸泡、洗滌多次，風(fēng)干，顯微鏡成像，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織中SECTM1的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，370例CRC組織樣本中，有277例SECTM1高表達(dá)（277/370，74.86%），高于配對癌旁組織（93/370，25.14%），見圖1。此外，SECTM1的表達(dá)與CRC分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、UICC分期和CEA水平無關(guān)（P＞0.05），見表1。

圖1 免疫組織化學(xué)染色法檢測CRC組織和配對癌旁組織中SECTM1的表達(dá)（×400）

表1 CRC患者SECTM1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（n=370，例）

2.2 慢病毒介導(dǎo)的CRC細(xì)胞中SECTM1 mRNA過表達(dá)或下調(diào) 采用qRT-PCR法檢測6種CRC細(xì)胞系（HCT116、HT29、Caco-2、RKO、DLD-1和HCT-8）和正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞系（NCW460）中SECTM1 mRNA的相對表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果顯示，HCT116細(xì)胞系中SECTM1低表達(dá)，DLD-1細(xì)胞系中SECTM1高表達(dá)，我們選擇以上2種細(xì)胞系進(jìn)行下一步實驗。設(shè)計siRNASECTM1和過表達(dá)SECTM1的慢病毒，然后轉(zhuǎn)染到CRC細(xì)胞中。根據(jù)熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞系（見圖2a）和DLD-1細(xì)胞系（見圖2b）。在慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后，相對于NC組，OE組HCT116細(xì)胞中SECTM1表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖2c。同樣，相對于NC組，KD1組和KD2組DLD-1細(xì)胞SECTM1的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖2d。

圖2 慢病毒介導(dǎo)的SECTM1過表達(dá)或敲除

2.3 慢病毒介導(dǎo)的CRC細(xì)胞中SECTM1蛋白表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果表明，在慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后，與NC組比，OE組HCT116細(xì)胞系中SECTM1蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），KD組DLD-1細(xì)胞系中SECTM1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖3。

圖3 SECTM1蛋白在HCT116細(xì)胞系和DLD1細(xì)胞系中的表達(dá)

2.4 SECTM1對CRC細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染5 d后，CCK-8檢測結(jié)果表明，與NC組相比，OE組HCT116細(xì)胞增殖能力增強（P＜0.05），表明該基因過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖；與NC組相比，KD組DLD-1細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P＜0.05），說明敲除該基因可以抑制細(xì)胞增殖。見圖4。

圖4 SECTM1對CRC細(xì)胞增殖的影響

2.5 SECTM1對CRC細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與NC組比，OE組HCT116細(xì)胞的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；KD組DLD-1細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01）。這些結(jié)果表明敲除SECTM1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見圖5。

圖5 SECTM1對CRC細(xì)胞凋亡的影響

2.6 SECTM1對CRC細(xì)胞周期的影響 為了驗證靶基因?qū)?xì)胞周期的影響，在轉(zhuǎn)染后第6天使用流式細(xì)胞術(shù)檢測PI熒光強度，該熒光強度直接反映DNA在細(xì)胞不同階段的分布情況。結(jié)果表明，與NC組比，OE組HCT116細(xì)胞G1期細(xì)胞的比例顯著下降，S期細(xì)胞比例和G2/M期的比例增加（P＜0.05），見圖6a、圖6b，這表明細(xì)胞周期進(jìn)程加快。與NC組比，KD組DLD-1細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），而S期和G2/M期的細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6c、圖6d，這表明，SECTM1基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期。

圖6 SECTM1對CRC細(xì)胞周期的影響

2.7 SECTM1對CRC細(xì)胞侵襲的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，侵襲小室實驗結(jié)果表明，相對于NC組，OE組HCT116細(xì)胞每個區(qū)域的侵襲細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.01），這表明，SECTM1的過度表達(dá)增強了細(xì)胞入侵。相對于NC組，KD組DLD-1細(xì)胞每個區(qū)域的侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.01），表明SECTM1下調(diào)抑制細(xì)胞侵襲。見圖7。

圖7 SECTM1對CRC細(xì)胞侵襲的影響（×200）

3 討論

SECTM1以一種可溶性跨膜蛋白形式存在于高爾基體中，與受體CD7結(jié)合誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN，并激活抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell, APCs），在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SECTM1在CRC中高表達(dá)，這與乳腺癌[10]和黑色素瘤[13]中觀察到的結(jié)果相似，提示SECTM1可能參與癌癥的發(fā)生。本研究進(jìn)一步分析了SECTM1在CRC組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SECTM1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CRC分化程度有關(guān)。KAMATA等[14]認(rèn)為SECTM1是一種上皮產(chǎn)物；然而，他們沒有提到成熟的腺上皮細(xì)胞中是否有一種物質(zhì)可以促進(jìn)SECTM1的高表達(dá)。許多研究稱，SECTM1能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，如T細(xì)胞與CD28的結(jié)合[11-12]，因此SECTM1與細(xì)胞免疫有關(guān)，是編碼與免疫信號通路相關(guān)的基因[15]。然而，還需要進(jìn)一步的研究來驗證。

我們進(jìn)一步分析SECTM1對CRC細(xì)胞的影響后發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，上調(diào)SECTM1后CRC細(xì)胞的生存能力和侵襲能力明顯增強，細(xì)胞周期加快，凋亡減少；下調(diào)SECTM1的表達(dá)則相反。WANG等[16]表明在黑色素瘤細(xì)胞系WM3899中SECTM1的過表達(dá)顯著增加了細(xì)胞侵襲，并促進(jìn)了腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在黑色素瘤細(xì)胞系WM9中降低SECTM1的表達(dá)，可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，這與我們的結(jié)果一致。然而，涉及SECTM1的致癌機制可能有不同的聲音：它部分依賴于CD7介導(dǎo)通路的激活來吸引單核細(xì)胞改變微環(huán)境[13]；另一部分依賴于調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，如SECTM1上調(diào)整合素β3的表達(dá)，從而促進(jìn)其自身在黑素瘤中的表達(dá)[15]。SECTM1在癌癥患者中似乎沒有體細(xì)胞突變[17]，但在癌癥[18]和其他疾病如腸易激綜合征[19]和黑素瘤[20]中經(jīng)常過表達(dá)，強調(diào)了對SECTM1基因表達(dá)的操縱也可能在癌細(xì)胞和腸黏膜上皮屏障細(xì)胞的免疫耐受中發(fā)揮作用?；蛘呤峭ㄟ^與CD4+T、CD8+T、抗原呈遞細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞的相互作用，SECTM1可以削弱機體的免疫防御，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，引起淋巴轉(zhuǎn)移。因此，SECTM1的表達(dá)可能是先天免疫反應(yīng)和癌細(xì)胞免疫耐受的關(guān)鍵因素[21]。

本研究有一些局限性，需要在動物實驗中進(jìn)一步證實。本研究也沒有探討SECTM1在CRC中的致癌機制。GU等[22]利用腫瘤基因組中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)篩選出免疫相關(guān)預(yù)后基因SECTM1。下一步的研究方向是研究SECTM1對CRC微環(huán)境的免疫相關(guān)作用，明確免疫相關(guān)通路、上下游因素。進(jìn)一步研究SECTM1靶向藥物通過共抑制或共刺激信號等一系列途徑調(diào)控免疫細(xì)胞活性，從而殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法。

綜上所述，本研究結(jié)果表明SECTM1是一個潛在的治療靶點，為未來CRC的靶向治療提供了重要的線索。