王志洲，鄒德寶，石 威,，姜紅江,*

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230000；2.山東省文登整骨醫(yī) 院，山東 威海264400）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH）是由于長期或大劑量服用激素使血管膠原纖維和彈性纖維功能障礙，股骨頭內微小動脈栓塞引起股骨頭發(fā)生局部或完全性的缺血，從而導致股骨頭壞死，是骨科臨床最常見的疑難疾病，其主要表現為髖部疼痛和髖關節(jié)內旋功能障礙[1-2]。 流行病學調查顯示，該病常見于30～50 歲的中青年男性人群，超一半以上的患者發(fā)病累及雙側[3]，已占據非創(chuàng)傷性股骨頭壞死總發(fā)病的近60%[4]， 且近年來發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，每年新增約15～20 萬病例[5-6]。 股骨頭壞死范圍廣，且進展不可逆，致殘率極高，已經嚴重危害患者的生命健康以及降低患者的生活質量[7]?，F今，對于SANFH的治療通常使用降脂、抗凝藥，其毒副作用大且療效不明顯， 所以需要迫切尋求更有效的防治方法。中醫(yī)藥具有幾千年的歷史文明， 其治療股骨頭壞死源來已久，具備完善的理論、豐富的臨床經驗和獨特的優(yōu)勢，可作為防治股骨頭壞死的首選方法。淫羊藿苷（icariin, ICA）是中藥淫羊藿的一種提取成分，有補腎、抗衰老的作用[8-9]。 現代藥理研究證實，ICA 具備優(yōu)良的促進成骨的功效， 但其治療SANFH 的作用機制尚不明確，此次實驗基于網絡藥理學和動物實驗驗證的方法進一步探討ICA 防治SANFH 的機制，以期為后續(xù)研究提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠共24 只，體質量270～310 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）20190003。動物飼養(yǎng)于山東省文登整骨醫(yī)院骨傷組織工程實驗室（三級），籠溫控制在（20±2） ℃，相對濕度45%～55%。本次實驗動物研究通過山東省文登整骨醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理審批編號：LL2022011501）。

1.2 實驗儀器

電子天平（型號：A2013，上海民橋精密科學儀器有限公司）;雙通道流量計（型號：MS-2，上海玉研科學儀器有限公司）；Micro-CT（型號：NMC-100，昆山平生醫(yī)療科技有限公司）；-80 ℃冰箱（型號：DW-86L338J，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；Western blot 系統（型號：VE-586，上海天能科技有限公司）；高速離心機（型號：Micro21R，賽默飛世爾科技公司）。

1.3 實驗藥物與試劑

ICA（批號：115H021，北京索萊寶科技有限公司）；脂多糖（批號：012021210430，北京碧云天生物技術有限公司）；甲潑尼龍（批號：20110408，國藥集團容生制藥有限公司）；青霉素鈉（批號：43201105，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；苯巴比妥鈉（批號：2103071，天津金耀生物科技有限公司）；異氟烷（批號：202106，北京科月華誠科技有限公司）；牛血清白蛋白、5%脫脂奶粉、RIPA 裂解液、PMSF、一抗/二抗稀釋液、PVDF 膜、TBST 溶液、特超敏ECL 試劑盒、p-ERK1 抗體、p-p38 抗體、p-JNK 抗體、GAPDH 抗體（北京碧云天生物技術有限公司，批號分別為ST025、P0216、P0013C、ST505、P0023A/P0023D、FFP26、P0231、P0018AS、AF1891、AF5884、AF5860、AF0006）。

2 方法

2.1 ICA 潛在靶點預測

通過TCMSP 數據庫[10]查詢ICA 的ADME 屬性值和CAS 號，從PubChem 數據庫[11]獲得ICA 2D 結構用于PharmMapper 數據庫[12]潛在靶點的預測，根據Norm Fit[12]進行潛在靶點篩選，完成后利用UniProt數據庫對蛋白質靶點進行標準化。

2.2 SANFH 相關靶點獲取

以“steroid -induced avascular necrosis of the femoral head”為主題詞，檢索OMIM 數據庫[13]、Gene-Cards 數據庫[14]、DisGeNET 數據庫[15]中SANFH 的相關靶點，合并3 個數據庫靶點，去重后得到SANFH的相關靶點。

2.3 PPI 網絡構建

為明確ICA 潛在靶點與SANFH 相關靶點之間的關系，將兩者靶點導入Venny 平臺制作韋恩圖。然后將共同靶點輸入STRING 數據庫[16]構建PPI 網絡模型，最小相互作用值設置為“medium confidence（0.400）”，隱藏網絡中斷開連接的節(jié)點，得到PPI 網絡，并通過Cytoscape 3.9.1[17]對PPI 網絡進一步分析，并構建ICA-SANFH 靶點的可視化網絡圖。

2.4 ICA 防治SANFH 相關靶點GO、KEGG 富集分析

將ICA 防治SANFH 的共同靶點錄入DAVID數據庫，根據count 值選用排名前10 位、前20 位數據導入微生信云平臺繪制GO 富集分析條形圖、KEGG 通路富集分析氣泡圖。 為更加直觀地顯示ICA 防治SANFH 所涉及KEGG 通路的相關靶點，運用Cytoscape 3.9.1 構建“靶點-信號通路”網絡圖。

2.5 實驗分組、造模與灌胃方法

24 只雄性SD 大鼠按隨機數字表法分成空白組（n=8）、模型組（n=8）、ICA 組（n=8）。 取模型組、ICA組共16 只大鼠造模，造模方法參照文獻[18]并進行適當改進。 造模組按2 mg·kg-1·d-1確定每只大鼠注射LPS 劑量。第3 天開始，造模大鼠臀肌交替注射甲潑尼龍40 mg·kg-1·d-1，連續(xù)10 d。 在注射甲潑尼龍后予腹腔注射青霉素鈉80 U·d-1以預防感染。 造模成功后普食飼養(yǎng)7 d，空白組、模型組均使用生理鹽水5 mL 灌胃，ICA 組按照實驗動物用藥換算法計算給藥劑量，將ICA 用生理鹽水配成5 mL 藥液進行灌胃，連續(xù)8 周。 所有實驗動物在相同條件下喂養(yǎng)，用懸吊法飲水使其下肢直立行走。 8 周后腹腔注射苯巴比妥鈉處死實驗動物，在清潔條件下剖開雙側股骨頭，剔除周圍軟組織后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 Micro-CT 定量分析股骨頭骨參數

在灌胃8 周后，腹腔注射相應濃度的苯巴比妥鈉深度麻醉所有實驗動物，在清潔條件下剖開雙側股骨頭， 使用Micro-CT 對大鼠股骨頭進行掃描定量，分析骨小梁參數如骨礦物質密度（bone mineral density, BMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number, Tb.N）和骨小梁分離度（trabecular spacing, Tb.Sp）4 個指標。

2.7 Western blot 檢測相關蛋白的表達

將大鼠股骨頭剪碎，與RIPA 裂解液、PMSF 進行混合后加入到離心管中，充分研磨并碾碎，再使用組織勻漿機充分裂解，結束后4 ℃離心10 min，取上清裝至離心管中以待檢測。使用BCA 蛋白質定量試劑盒測定蛋白含量。取適量上清，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。 加入一抗（p-ERK1 按1∶2000 稀釋、p-p38 按1∶1000 稀 釋、p-JNK 按1∶1000 稀 釋，GAPDH 按1∶5000 稀釋），4 ℃孵育過夜。 洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h。TBST 溶液洗3 遍，使用ECL試劑盒進行顯影。以GAPDH 為內參，計算各蛋白相對表達量。

2.8 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件對本次實驗所有數據進行統計分析，計量資料使用“±s”的形式表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數據采用單因素方差分析。 取顯著性水平α=0.05，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ICA 靶點的篩選

通過TCMSP 數據庫查詢到ICA 的CAS 號為489-32-7，OB 值為41.58%，DL 值為0.61，符合篩選原則[19]。 PharmMapper 數據庫初步提取前300 位的靶點，對根據Norm Fit≥0.5 篩選得到的靶點進行標準化，去重后得到預測靶點226 個，排名前50 位的預測靶點見表1。

表1 ICA 的預測靶點

3.2 SANFH 相關靶點的獲取

從OMIM、GeneCards、DisGeNET 數據庫中分別獲得SANFH 相關靶點84 個、571 個、74 個，合并3個數據庫的相關靶點后除去重復值，最終得到677個SANFH 相關靶點。

3.3 PPI 網絡的構建

將篩選出來的ICA 靶點與SANFH 靶點取交集，并通過Venny 平臺制作韋恩圖，得到ICASANFH 共同靶點53 個，見圖1。 進而將共同靶點輸入STRING 平臺，得到ICA-SANFH 靶點PPI 網絡，排除1 個游離的靶點蛋白（無相互作用蛋白），見圖2。 為了進一步篩選出有較多交互關系的靶點，利用Cytoscape 平臺，根據Degree>30 篩選出更為重要的共同靶點聚類，見圖3。

圖1 ICA-SANFH 靶點韋恩圖

圖2 ICA-SANFH 靶點PPI 網絡圖

圖3 共同靶點聚類

3.4 GO、KEGG 富集分析

將53 個共同靶點導入DAVID 數據庫進行GO富集分析，根據count 值分別選取排名前10 位的靶點運用微生信平臺對結果進行可視化，見圖4。 由結果可見ICA 參與的重要生物進程包含凋亡過程的負調節(jié)、細胞增殖的正向調控和信號轉導等，在細胞組分中主要作用于細胞外隙、細胞質和胞質溶膠等，調節(jié)SANFH 的功能主要富集于蛋白結合、相同的蛋白結合和ATP 結合等。 根據count 值選用KEGG通路結果中排名前20 位的通路繪制成氣泡圖，見圖5。KEGG 富集通路提示ICA 可以通過癌癥、MAPK、PI3K-Akt 等信號通路和MAPK8、MAPK10、MAPK14、AKT1、EGFR 等主要靶點參與調控SANFH。 為了更加直觀地顯示ICA 治療SANFH 的KEGG 通路所涉及的相關靶點，使用Cytoscape 軟件構建的“靶點-信號通路”網絡圖共有56 個節(jié)點，213 條邊，見圖6。從圖中可知，每條通路可能富集到多個靶點基因，而一個靶點基因同時又出現在多條KEGG 通路中。

圖4 ICA 治療SANFH 靶點GO 富集分析條形圖

圖5 ICA 治療SANFH 靶點KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖6 ICA 治療SANFH“靶點-信號通路”網絡圖

3.5 Micro-CT 掃描骨參數結果

Micro-CT 掃描結果顯示：空白組大鼠股骨頭骨小梁結構致密有規(guī)則，未見壞死征象；模型組大鼠股骨頭明顯骨質疏松，骨小梁變細、斷裂，骨小梁間隙明顯增寬，提示有明顯骨壞死征象；相比于模型組，ICA 組大鼠股骨頭骨小梁結構增多，間隙有改善，稍有骨小梁變細、斷裂跡象，骨壞死范圍明顯減少，見圖7。 Micro-CT 掃描結果顯示：相比于空白組，模型組和ICA 組的BMD、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 指標差異均具有統計學意義（P＜0.05）；相比于模型組，ICA 組的BMD、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 指標差異均具有統計學意義（P＜0.05）。 詳見表2。

圖7 Micro-CT 掃描的大鼠股骨頭征象

表2 Micro-CT 骨參數比較（n=8，±s）

表2 Micro-CT 骨參數比較（n=8，±s）

注：與空白組相比，△P＜0.01；與模型組相比，▲▲P＜0.01。

指標BMD Tb.Th Tb.N Tb.Sp空白組0.909±0.029 0.649±0.035 6.113±0.211 0.055±0.005模型組0.674±0.044△0.377±0.033△3.146±0.198△0.146±0.015△ICA 組0.741±0.035▲▲0.512±0.033▲▲3.946±0.226▲▲0.105±0.006▲▲

3.6 Western blot 檢測p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表達結果

3 組大鼠骨組織內p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表達情況見圖8。根據表3 可知，相比于空白組，模型組p-ERK1 蛋白明顯降低（P＜0.05），p-p38、p-JNK蛋白明顯增加（P＜0.05）；相比于模型組，ICA 組p-ERK1 蛋白明顯升高（P＜0.05），p-p38 蛋白降低（P＜0.05），p-JNK 蛋白明顯降低（P＜0.05）。

表3 3 組p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表達比較（n=8，±s）

表3 3 組p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表達比較（n=8，±s）

注：與空白組相比，△P＜0.01；與模型組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

ICA 組0.699±0.034▲▲0.98±0.045▲0.99±0.068▲▲指標p-ERK1 p-p38 p-JNK空白組0.959±0.037 0.848±0.037 0.824±0.018模型組0.563±0.04△1.086±0.088△1.159±0.07△

圖8 大鼠股骨頭p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白的表達情況

4 討論

在中醫(yī)學中，根據股骨頭壞死的臨床癥狀、發(fā)病特點，結合中醫(yī)古籍論述，早期股骨頭壞死歸屬于 “骨痹”“痹證”， 進一步缺血性壞死則歸類為“骨痿”“骨蝕”的范疇[20]。 《素問·長刺節(jié)論篇》[21]有骨痹的記載。 《脾胃論》認為腎藏精，主骨，生髓，髓養(yǎng)骨，骨枯髓減，發(fā)為骨蝕。 《素問》就有“腎主身之骨髓……發(fā)為骨痿之癥”的記載。 從發(fā)病形態(tài)、致病機制、臨床癥狀上看，可認為股骨頭壞死屬于中醫(yī)學中的“骨蝕”“骨痿”“骨痹”。 其病機主要為腎虛和血瘀。 治療上以補肝腎、強筋骨、祛瘀生新為主。

由于ICA 可能通過不同的靶點和信號通路對SANFH 進行調節(jié)，因此借助網絡藥理學的手段加以預測分析。 本次PPI 網絡分析結果得到的核心靶點有ALB、AKT1、MAPK9、IGF1、EGFR 等，表明ICA防治SANFH 具有多靶點的特征。 SANFH 的發(fā)病首先侵犯的是軟骨，參與關節(jié)軟骨細胞增殖、分化的信號通路對于治療SANFH 至關重要。KEGG 通路富集分析結果顯示，ICA 治療SANFH 涉及的主要信號通路有癌癥、MAPK、PI3K-Akt 通路等。 （1）癌癥通路：包含了諸多通路如Wnt 信號通路、Hedgehog信號通路、Notch 信號通路等多個下游通路[22]，比較復雜。其中，Wnt 蛋白是一組分泌型糖蛋白，是促進成骨細胞分化和活性的重要調節(jié)因子[23]。 （2）MAPK 信號通路：該通路屬于關節(jié)軟骨損傷的重要信號傳導通路[24]，能夠影響成骨細胞的分化和凋亡[25]。 （3）PI3K-Akt 信號通路：該通路屬于調節(jié)自噬的經典通路，參與調節(jié)關節(jié)軟骨細胞的平衡[26]，已被證實與血管修復再生、成骨細胞和破骨細胞分化密切相關[27]。 由此預測，ICA 可通過ALB、AKT1、MAPK9、IGF1、EGFR 等靶點作用于癌癥、MAPK、PI3K-Akt 等通路調控SANFH 的發(fā)生。

為進一步研究網絡藥理學預測的科學意義，對MAPK 通路的靶點進行驗證，采用甲潑尼龍聯合LPS 的方式誘導SANFH 大鼠模型，并予以ICA 灌胃處理。 動物藥理實驗結果顯示：與空白組相比，模型組大鼠BMD、Tb.Th、Tb.N 和Tb.Sp 指標差異均具有統計學意義(P＜0.05)，p-ERK1 蛋白表達顯著降低(P＜0.05)，p-p38 蛋白和p-JNK 蛋白顯著升高(P＜0.05)；與模型組相比，ICA 組大鼠BMD、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp 均具有統計學意義(P＜0.05)，p-ERK1 蛋白表達顯著升高(P＜0.05)，p-p38 蛋白和p-JNK 蛋白顯著降低(P＜0.05)。 既往研究發(fā)現，ICA 具有改善骨代謝和增強骨密度與強度的作用[28]，同時ICA 可作為細胞外因素刺激MAPK 信號通路進行成骨分化[29]。MAPK 家族主要包括ERK、p38、JNK。 WAN 等[30]研究證實ERK 的激活或抑制可以調控成骨分化。在成骨分化過程中，調控p38 相關通路有助于促進成骨細胞功能表達和體內骨礦化[31]。 JNK 相關通路與ERK 和p38 通路存在相互作用和密切聯系，是機體細胞代謝過程中重要的調節(jié)點，在成骨細胞分化中發(fā)揮著重要作用[32]。 YOON 等[33]研究發(fā)現JNK 相關通路是軟骨細胞代謝過程中重要的調控環(huán)節(jié)。 結合實驗結果說明，ICA 能夠提高骨密度，同時具有促進成骨細胞生成，從而對SANFH 發(fā)揮治療作用，證明了ICA 對MAPK 通路是存在作用的。

綜上所述，本次研究采用網絡藥理學結合動物藥理實驗的方法證實了ICA 經MAPK 信號通路治療SANFH 的作用機制，具有一定的應用價值，且課題組將在后續(xù)研究中會使用不同濃度的ICA，深入研究其治療SANFH 的作用機制，從而更好地為藥物的研發(fā)提供新思路。