邱心悅，石潤(rùn)玉，袁志鷹*， 趙洪慶*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

焦慮性抑郁癥是一種以抑郁癥狀為主，且伴隨著顯著焦慮情緒的精神障礙類疾病。臨床研究顯示，85%的抑郁癥患者有不同程度的焦慮情緒，焦慮情緒是導(dǎo)致抑郁癥治療阻抗最主要的因素之一[1]。 因而，焦慮性抑郁癥患者具有更重的社會(huì)功能損害和更高的自殺率[2]。 焦慮性抑郁癥屬于中醫(yī)情志病范疇，古代雖無(wú)其病名，但與東漢張仲景所著《金匱要略》中“百合病”癥狀極為類似，患者表現(xiàn)出“意欲食復(fù)不能食，欲臥不能臥，欲行不能行”“常默默”“如寒無(wú)寒，如熱無(wú)熱”等[3]。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抑郁、焦慮行為，結(jié)合臨床表現(xiàn)及中醫(yī)證候特點(diǎn)，認(rèn)為其基本病機(jī)可用基于腦府和肝臟的“瘀、郁”概括[4]。 百合疏肝安神湯是課題組基于仲景論治百合病的學(xué)術(shù)思想，緊扣抑郁癥“瘀、郁”的中醫(yī)病因病機(jī)特點(diǎn)，以疏肝理氣、活血安神為治法，結(jié)合多年臨床實(shí)踐研制而成，主治伴焦慮、失眠型抑郁癥，前期研究表明其具有良好的抗焦慮抑郁療效[5-6]，但由于中藥復(fù)方存在多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，使得相互作用機(jī)制并不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物學(xué)、藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科融合而成的一門學(xué)科。與傳統(tǒng)的單成分、單靶點(diǎn)思維不同，其多成分、多靶點(diǎn)、多通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建思維更適用于中藥復(fù)方的復(fù)雜特性，能夠減少中藥復(fù)方研究的盲目性，更便于發(fā)現(xiàn)治療疾病的潛在靶標(biāo)與分子機(jī)制[7]。 但是，單純運(yùn)用現(xiàn)有化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)對(duì)中藥材進(jìn)行成分篩選，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究極有可能導(dǎo)致過(guò)濾掉藥物的某些有效成分，且工作量大，潛在靶點(diǎn)多，不利于后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。 本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行成分分析，明確藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探明百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的活性成分及潛在靶點(diǎn)，闡明該方的作用環(huán)節(jié)、途徑與靶點(diǎn)，將有助于該方藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 百合疏肝安神湯化學(xué)成分分析

1.1.1 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)，流動(dòng)相由有機(jī)相乙腈（A）和水相（B）組成，其中水相B 中含0.05 mmol·L-1甲酸銨(質(zhì)譜級(jí))，設(shè)置梯度洗脫程序：0～5 min，5%～15% A；5～10 min，15%～35% A；10～20 min，35%～65% A；20～30 min，65%～95% A；流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：采用正負(fù)離子分析模式，離子化方式為電噴霧離子化(ESI)。一級(jí)質(zhì)譜掃描檢測(cè)范圍：m/z 100～1700，采用氮?dú)鉃槌軇└稍餁怏w，溫度為325 ℃，流速為6.8 L/min；鞘氣溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓為4.0 kv，F(xiàn)ragment 電壓為150 V；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m/z 50～1000。

1.1.2 百合疏肝安神湯樣品溶液的制備 百合疏肝安神湯由百合、柴胡、貫葉金絲桃、姜黃、酸棗仁、人參、紫蘇7 味藥物組成，藥材飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院袁志鷹副教授鑒定為正品。全方煎煮2 次，每次均加入6倍體積水，合并水煎液，濃縮至生藥量為1 g/mL 備用。 取1 mL 濃縮液，加20 mL 甲醇，超聲20 min，10 000 r/min 離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)，即得百合疏肝安神湯的樣品溶液。

1.1.3 百合疏肝安神湯的化學(xué)成分鑒定 采用全掃描-動(dòng)態(tài)排除和數(shù)據(jù)依賴性掃描，基于Agilent 1290 UPLC-6540 accurate mass Q-TOF 色譜-質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)百合疏肝安神湯中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集。 采用Mass Hunter B.07.00 軟件對(duì)正負(fù)離子模式的一、二級(jí)質(zhì)譜提供的離子峰信息進(jìn)行分析，根據(jù)文獻(xiàn)推測(cè)總結(jié)不同類別化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對(duì)于已知化合物，通過(guò)提取離子流圖和比對(duì)相關(guān)對(duì)照品保留時(shí)間等達(dá)到準(zhǔn)確快速鑒定，對(duì)于未知化合物，通過(guò)精確分子量預(yù)測(cè)化合物分子式，結(jié)合相關(guān)質(zhì)譜裂解規(guī)律、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)、多級(jí)質(zhì)譜碎片信息達(dá)到快速鑒定。

1.2 百合疏肝安神湯網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1 作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）將“1.1.3”中檢測(cè)出的化學(xué)成分進(jìn)行信息檢索，得到百合疏肝安神湯活性成分的靶標(biāo)蛋白。 借助STRING（https://string-db.org/）中Multiple proteins 搜索功能以及UniProt（http://www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白質(zhì)名稱，限制物種為“Homo sapiens”， 查詢與目標(biāo)蛋白質(zhì)相對(duì)應(yīng)的基因名稱，并校準(zhǔn)所得蛋白質(zhì)，同時(shí)剔除非目標(biāo)活性成分，獲得活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)的信息。

1.2.2 疾病靶點(diǎn)的獲取與收集 在GeneCards（https://www.genecards.org/）中以關(guān)鍵詞“anxious depression”進(jìn)行查詢，整合結(jié)果至Excel，與百合疏肝安神湯候選靶標(biāo)蛋白共同上傳至VENNY 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進(jìn)行匹配映射。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）的構(gòu)建及其核心靶點(diǎn)、重要成分的篩選 為了解百合疏肝安神湯的具體作用機(jī)制，將共同基因?qū)隨TRING 11.5，限制物種為“Homo sapiens”，置信度為中等0.04，以此獲取PPI 關(guān)系。 再將各參數(shù)以tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0（https://cytoscape.org/），對(duì)節(jié)點(diǎn)度值進(jìn)行分析，確定百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的核心靶點(diǎn)，進(jìn)而得到對(duì)應(yīng)的重要化學(xué)成分。

1.2.4 生物過(guò)程和通路分析 為了解核心基因的功能以及在信號(hào)通路中的作用，將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），物種限制為“Homo sapiens”，閾值設(shè)定P＜0.05，進(jìn)行基因本體論（gene ontology, GO）功能和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析，再借助ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index）和GraphPad Prism 7.0 將結(jié)果可視化。

1.2.5 “活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將結(jié)果所得的成分、靶點(diǎn)、通路等信息在Excel中建立三者的數(shù)據(jù)文件和屬性文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 百合疏肝安神湯主要化學(xué)成分

通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析得到百合疏肝安神湯總離子流圖，見(jiàn)圖1。 經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比，完成色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的定性分析，得到78 個(gè)化合物，主要包括精氨酸、葡萄糖酸、檸檬酸、異檸檬酸、郁金香苷A 等。 詳見(jiàn)表1。

表1 百合疏肝安神湯主要化學(xué)成分

續(xù)表1

圖1 百合疏肝安神湯正負(fù)離子模式總離子流圖譜

2.2 藥物及疾病共同基因的篩選

利用TCMSP 檢索得到藥物靶點(diǎn)144 個(gè)，去除重復(fù)基因后有101 個(gè)；通過(guò)GeneCards 檢索所得疾病靶點(diǎn)1338 個(gè)，無(wú)重復(fù)基因。將二者上傳至Venny 2.1.0匹配映射后，獲取共同靶點(diǎn)52 個(gè)。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 百合疏肝安神湯中化合物及其與焦慮性抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)的交集基因

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

借助STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI，共得到11個(gè)節(jié)點(diǎn)和644 條邊，見(jiàn)圖3。 將共同靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)成分導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值大小進(jìn)行比較分析，節(jié)點(diǎn)的平均度值為58.55，以大于等于兩倍中心平均度值為標(biāo)準(zhǔn)，得到治療焦慮性抑郁癥作用靶點(diǎn)8 個(gè)， 分別為CAT、IL-1β、PTGS2、IL-6、INS、CASP3、SRC、MYC，見(jiàn)表2，對(duì)應(yīng)化合物14 個(gè)，具體見(jiàn)表3。

表2 拓?fù)浞治? 個(gè)核心靶點(diǎn)信息

表3 拓?fù)浞治?4 個(gè)重要化合物信息

圖3 百合疏肝安神湯與焦慮性抑郁癥PPI 核心網(wǎng)絡(luò)

2.4 生物過(guò)程和通路富集分析

DAVID 中GO 功能富集分析中獲得的GO 條目共252 個(gè)（P＜0.05），其中包括生物過(guò)程（biological process, BP）條目181 個(gè)，涉及對(duì)藥物的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)雌二醇刺激的反應(yīng)等；細(xì)胞組成（cellular component, CC）條目31 個(gè)，涉及神經(jīng)元投影、細(xì)胞溶質(zhì)、膜式筏板等；分子功能（molecular function, MF）條目40 個(gè)，涉及血紅素結(jié)合、NADP 綁定、蛋白質(zhì)同型二聚體活性等。該結(jié)果中BP、CC 和MF 分別占71.8%、12.3%和15.8%，運(yùn)用GraphPad Prism 7.0 對(duì)GO 功能富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 百合疏肝安神湯活性成分潛在靶點(diǎn)的GO 功能富集分析

KEGG 通路富集結(jié)果經(jīng)過(guò)濾選擇共獲得82 條信號(hào)通路（P＜0.05），涉及HIF-1 信號(hào)通路、PI3KAkt 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等。運(yùn)用ImageGP 對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。 詳見(jiàn)圖5。

圖5 百合疏肝安神湯活性成分潛在抗焦慮性抑郁癥靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路富集分析

2.5 百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)

百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)如圖6 所示。 該網(wǎng)絡(luò)中共涉及30 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括12 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、8 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)、10 個(gè)通路節(jié)點(diǎn)）和156 條邊，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)目為5.20。 結(jié)果表明百合疏肝安神湯中存在化合物與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用的機(jī)制，同時(shí)存在幾種化合物同時(shí)擴(kuò)散至同一靶標(biāo)的過(guò)程，最后作用于多種通路。

圖6 百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

本研究通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析了百合疏肝安神湯的78 種活性成分，其中肉豆蔻醚、蘆丁、紫堇定堿等度值較大，且與核心靶點(diǎn)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，表明其可能為百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的重要活性成分。有研究指出，肉豆蔻醚表現(xiàn)出明顯的抗抑郁性質(zhì)，其依賴于5-HT 功能的調(diào)節(jié)，抑制5-HT2A 受體活性達(dá)到緩解抑郁的作用[8-9]。 蘆丁是一種天然黃酮苷，屬于黃酮類化合物，研究表明其能夠增加大鼠進(jìn)入高架十字迷宮開(kāi)放臂的次數(shù)與時(shí)間，發(fā)揮抗焦慮作用[10]。 同時(shí)，黃酮類化合物能抑制單胺氧化酶活性，影響5-HT 的重吸收，起到抗抑郁的作用[11]。研究顯示，阿樸啡類生物堿具有抗氧化作用[12]，其機(jī)制可能通過(guò)對(duì)抗自由基絡(luò)合或者主動(dòng)捕獲自由基的方式，阻止機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而發(fā)揮抗焦慮抑郁作用[13]。

由“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)可知，PTGS2、IL-6、IL-1β 與PI3K-Akt 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路相連成分較多，可能為抗焦慮性抑郁癥的潛在靶點(diǎn)與通路。

PTGS2 又名環(huán)氧合酶2，是花生四烯酸合成前列腺素類物質(zhì)的關(guān)鍵性限速酶，其含量高低能夠影響海馬、杏仁核等腦區(qū)的功能，可能參與焦慮性抑郁癥的病理進(jìn)程[14]。PI3K-Akt/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥的發(fā)生等發(fā)揮著不容忽視的作用[15]。PI3K-Akt 信號(hào)通路可與NF-κB 信號(hào)通路產(chǎn)生交叉反應(yīng)，在一定程度上對(duì)其活性進(jìn)行調(diào)節(jié)[16-17]。DOU 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt 信號(hào)通路可能通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，進(jìn)而達(dá)到抗焦慮性抑郁癥的作用。 同時(shí)，PI3KAkt 信號(hào)通路還可以通過(guò)增強(qiáng)NF-κB 抑制蛋白IκB激酶的磷酸化和降解，繼而導(dǎo)致NF-κB 的活化，誘導(dǎo)促炎因子(如TNF-α、IL-6 和IL-1β)釋放[19]。因此，百合疏肝安神湯可能通過(guò)介導(dǎo)PI3K-Akt、NF-κB 信號(hào)通路，抑制海馬細(xì)胞凋亡或促炎因子過(guò)量分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)抗焦慮性抑郁癥作用。

綜上所述，本研究在百合疏肝安神湯化學(xué)成分的測(cè)定分析基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，分析了百合疏肝安神湯14 種重要活性成分、8 個(gè)抗焦慮性抑郁的潛在作用靶點(diǎn)，可能通過(guò)肉豆蔻醚、蘆丁、紫堇定堿等活性成分作用于PTGS2、IL-6、IL-1β等潛在靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt、NF-κB 等信號(hào)通路，在神經(jīng)元投影、細(xì)胞溶質(zhì)、膜式筏板等區(qū)域參與對(duì)藥物的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)雌二醇刺激的反應(yīng)、血紅素結(jié)合、NADP綁定、蛋白質(zhì)同型二聚體活性等過(guò)程，發(fā)揮抗焦慮性抑郁癥作用。