譚怡絲，譚 勁*，朱可可，符 靜，王宗康

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis, OSF）是一種慢性的、進行性的、不可逆的膠原代謝紊亂，黏膜纖維化和功能改變，會引起口腔灼燒感，口腔黏膜變白變硬，牙關(guān)緊閉和張口受限，并有惡性轉(zhuǎn)化的潛在風險[1-2]。文獻表明，OSF 對許多患者的口腔健康相關(guān)生活質(zhì)量有顯著影響，大部分患者對自己的口腔健康狀況不滿意[3-4]。 在亞洲，咀嚼檳榔是公認的OSF 的主要危險因素。 檳榔堿是檳榔的主要藥理活性成分[5]，檳榔堿可引起炎癥和細胞膠原代謝紊亂而誘發(fā)OSF，咀嚼檳榔誘發(fā)口腔黏膜炎癥是OSF 發(fā)病機制中的關(guān)鍵事件[6-7]。 然而，當前關(guān)于現(xiàn)有治療方法緩解OSF 癥狀的證據(jù)還很薄弱。

本團隊采用加味丹玄口康治療OSF， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)加味丹玄口康可以增強Axin 基因在檳榔提取物（areca nut extract, ANE）誘導(dǎo)的大鼠上皮細胞中的表達，能拮抗檳榔堿對于黏膜上皮細胞的細胞毒性，抑制膠原的合成并改善OSF 癥狀[8-10]。為了進一步驗證其療效機制，本實驗通過ELISA 法觀察加味丹玄口康對檳榔堿誘導(dǎo)的OSF 大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、γ 干擾素（interferon-γ, IFN-γ）水平的影響，同時觀察各組大鼠口腔黏膜病理形態(tài)及張口度和血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平，并進行對比和相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF 級SD 大鼠，60 只，體質(zhì)量220～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0004。 實驗通過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查（審批號：LLBH-202103100002）。 大鼠自由攝食及飲水，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。

1.2 藥物

中藥加味丹玄口康配方：丹參10 g，玄參10 g，生地黃10 g，白芍10 g，生黃芪10 g，當歸10 g，紅花5 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，茵陳10 g，薄荷10 g，桔梗10 g。 均由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，為同一批次同一產(chǎn)地藥材。將以上12 味藥按處方量取14 劑，一劑生藥（共115 g）加入500 mL 溫開水沖泡并充分攪拌，使用水煎濃縮的方法將藥物濃縮成500 mL 液體，生藥濃度為0.23 g/mL。 低、中、高劑量加味丹玄口康大鼠灌胃量按照成人每日用量的1、2、3 倍，定為等效劑量（正常成人體質(zhì)量按60 kg 進行換算），即分別按4、8、12 mL/kg灌胃，1 次/d，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 主要試劑及儀器

氫溴酸檳榔堿（成都德斯特生物有限公司，批號：300-08-3）；TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、LDH ELISA試劑盒均購自江蘇菲亞生物科技有限公司（批號分別為2109R11、2109R16、2109R19、2109R20、2109R25）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司，型號：DHP-9402L）；酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號：RT-6100）；微量高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，型號：TG16W）；臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號：TGL16M）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及模型制備 將60 只雄性SD 清潔級大鼠隨機分為5 組（正常組、模型組和加味丹玄口康低、中、高劑量組），每組12 只。正常組不作任何干預(yù)，模型組及加味丹玄口康低、中、高劑量組參照本課題組前期造模方法[10]構(gòu)建OSF 模型：48 只大鼠乙醚麻醉后，在頰黏膜下注入10 mg/mL 的ANE 0.2 mL，再用自制刷蘸ANE，上下、前后各刷20 次，之后禁水禁食2 h。 1 次/d，連續(xù)8 周后，48 只大鼠均出現(xiàn)明顯張口受限，頰黏膜蒼白，捫之發(fā)硬，黏膜下可捫及條索狀改變，提示模型建立成功。

1.4.2 藥物干預(yù) 加味丹玄口康低、中、高劑量組以組方4、8、12 g/kg（按照體表面積藥物劑量換算公式計算，分別相當于60 kg 成人劑量的1、2、3 倍）灌胃8 周，1 次/d，模型組以每天10 mL/kg 蒸餾水灌胃，正常組不作任何干預(yù)。

1.4.3 開口度測定 最后一次灌胃后，各組大鼠禁食、禁水24 h，對SD 大鼠腹腔注射水合氯醛（3 mL/kg，10%），固定大鼠上頜切牙，用彈簧拉力器（1 N）牽拉大鼠下頜，再用游標卡尺測量上下切牙切緣之間的距離，每只大鼠測量3 次，精確到0.1 mm，取平均值。

1.4.4 口腔頰黏膜組織的HE 染色觀察 開口度測定后，隨機取一側(cè)大鼠口腔頰黏膜，生理鹽水沖洗后放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，采用常規(guī)HE 染色方法進行染色，顯微鏡下觀察頰黏膜組織病理改變情況。

1.4.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 和LDH 的ELISA 檢測 開口度測定結(jié)束后，打開大鼠腹腔，從腹主動脈采血，嚴格按照ELISA 試劑盒說明步驟檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、LDH水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0 進行處理，并采用GraphPad Prism 9 進行圖形繪制和相關(guān)性分析。 計量資料以“±s”描述，組間比較采用完全隨機設(shè)計單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用最小顯著差法（LSD）。 采用Spearman 相關(guān)檢驗進行相關(guān)性分析，R 為相關(guān)系數(shù)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

實驗過程中，正常組、模型組、加味丹玄口康低劑量組、加味丹玄口康中劑量組、加味丹玄口康高劑量組分別意外死亡3、2、4、2、3 只大鼠。

2.1 各組大鼠張口度、血清LDH 比較

與正常組比較，模型組張口度明顯降低（P＜0.05），血清LDH 水平明顯升高（P＜0.05）。 與模型組比較，加味丹玄口康高、中、低劑量組張口度均明顯升高（P＜0.05），血清LDH 水平均明顯降低（P＜0.05）。 與加味丹玄口康低劑量組比較，加味丹玄口康中、高劑量組血清LDH 水平明顯降低（P＜0.05），加味丹玄口康高劑量組張口度明顯升高（P＜0.05）。 與加味丹玄口康中劑量組比較，加味丹玄口康高劑量組張口度明顯升高（P＜0.05），血清LDH 水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠張口度和血清LDH 水平比較(±s)

表1 各組大鼠張口度和血清LDH 水平比較(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與加味丹玄口康低劑量組比較，△P＜0.05；與加味丹玄口康中劑量組比較，◇P＜0.05。

組別正常組模型組加味丹玄口康低劑量組加味丹玄口康中劑量組加味丹玄口康高劑量組n9 1 0 81 0 9張口度/mm 22.14±1.67 16.65±1.13*18.04±1.16*#18.65±0.86*#19.71±0.85*#△◇LDH/(ng·mL-1)27.99±1.63 58.77±2.46*52.39±2.19*#48.78±2.57*#△34.22±2.70*#△◇

2.2 各組大鼠血清免疫細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IFN-γ 水平比較

與正常組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05），血清IFN-γ 水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，加味丹玄口康高、中、低劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），血清IFN-γ 水平明顯升高（P＜0.05）。與加味丹玄口康低劑量組比較，加味丹玄口康中劑量組血清IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），加味丹玄口康高劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均明顯降低（P＜0.05），加味丹玄口康中、高劑量組血清IFN-γ 水平均顯著升高（P＜0.05）。 與加味丹玄口康中劑量組比較，加味丹玄口康高劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均明顯降低（P＜0.05），血清IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 水平比較(±s，pg/mL)

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 水平比較(±s，pg/mL)

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與加味丹玄口康低劑量組比較，△P＜0.05；與加味丹玄口康中劑量組比較，◇P＜0.05。

組別正常組模型組加味丹玄口康低劑量組加味丹玄口康中劑量組加味丹玄口康高劑量組n 91 0 81 0 9 TNF-α 119.52±7.42 236.74±10.21*179.74±7.48*#173.51±8.16*#154.52±11.22*#△◇IL-1β 16.77±2.55 38.36±2.28*31.17±1.68*#25.83±1.63*#△21.98±1.59*#△◇IL-6 76.90±4.81 139.25±2.89*118.67±3.55*#114.47±4.12*#△99.13±2.54*#△◇IFN-γ 1 387.86±47.62 724.52±38.35*845.44±50.87*#952.27±32.50*#△1 077.11±49.13*#△◇

2.3 各組大鼠口腔頰黏膜組織病理形態(tài)

正常組口腔頰黏膜上皮角化層呈淡紅均質(zhì)狀，顆粒層、棘細胞層、基底層結(jié)構(gòu)清晰，釘突排列規(guī)則，無炎癥細胞浸潤。 模型組頰黏膜上皮層結(jié)構(gòu)紊亂，上皮萎縮，釘突消失，血管數(shù)量明顯減少，血管狹窄或閉塞，固有層和黏膜下層纖維增生，存在炎癥細胞浸潤。 加味丹玄口康低劑量組頰黏膜顆粒層、棘細胞層、基底層恢復(fù)，纖維增生明顯改善，血管數(shù)量恢復(fù)，存在少許炎癥細胞浸潤。 加味丹玄口康中劑量組頰黏膜纖維增生顯著改善，上皮層結(jié)構(gòu)恢復(fù)，但結(jié)構(gòu)尚不清晰，部分上皮萎縮。 加味丹玄口康高劑量組頰黏膜角化層、顆粒層、棘細胞層、基底層結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，纖維化顯著改善。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠頰黏膜組織病理形態(tài)（HE，×100，bar=100 μm）

2.4 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 與OSF 指標的相關(guān)性分析

OSF 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平與張口度均呈高度負相關(guān)（P＜0.01），與血清LDH 水平呈高度正相關(guān)（P＜0.01）；OSF 大鼠血清IFN-γ 水平與張口度呈高度正相關(guān)（P＜0.01），與血清LDH 水平呈負相關(guān)（P＜0.01）。 詳見圖2。

圖2 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 與OSF 指標的相關(guān)性分析

3 討論

OSF 伴有明顯的免疫微環(huán)境變化，免疫調(diào)節(jié)與OSF 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，免疫反應(yīng)的失衡及其他因素共同作用，導(dǎo)致組織纖維化。 檳榔堿可引起口腔黏膜組織病變，并改變細胞因子和促炎因子的水平，如上調(diào)白細胞介素-1、IL-6、白細胞介素-8（interleukin-8, IL-8）、TNF-α 和轉(zhuǎn)化生長因子-β1 水平而促進組織纖維化[11]。 在OSF 患者血清中可發(fā)現(xiàn)大量免疫細胞分泌的細胞因子參與了OSF 過程，促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平升高，抗纖維化因子IFN-γ 水平降低，這可能是OSF 發(fā)病機制的核心[12]。 此外，TNF-α 可以刺激成纖維細胞增殖，TNF-α 編碼基因的多態(tài)性已被報道為OSF 的一個重要危險因素[13]。 在中國患者的研究中發(fā)現(xiàn)，血清IL-6 水平可作為中藥治療的指標[14]，為本研究針對IL-6 水平的檢測提供了理論依據(jù)。 多項研究表明血清LDH 可作為評價OSF 早期診斷和預(yù)后的生物標志物[15-16]，因此，本研究同時進行了血清LDH 水平的檢測。 目前，針對OSF 的治療方法雖多，有理想效果者卻甚少，因此，尋找有效防治OSF 的藥物來緩解乃至治愈患者黏膜下纖維化癥狀具有重要意義。

名老中醫(yī)李元聰教授認為，OSF 是由于嗜食辛辣燥熱等熱毒刺激之物，溫熱邪毒因而外侵，引起人體局部氣血通機不暢，氣滯血瘀，熱毒蘊久，日久生痰、生瘀互損而致發(fā)病[17]。本研究在采用古方桃紅四物湯的基礎(chǔ)上加減，選擇了丹參、玄參、生地黃、白芍、生黃芪、當歸、紅花、白花蛇舌草、夏枯草、茵陳、薄荷、桔梗研制成加味丹玄口康。 方中丹參、當歸、紅花養(yǎng)血活血、化瘀止痛；玄參、生地黃清熱涼血、滋陰降火；白芍、生黃芪益氣扶正；白花蛇舌草、茵陳清熱利濕、解毒散瘀；桔梗、夏枯草祛痰散結(jié)；薄荷疏風散熱；全方共奏扶正活血、解毒化瘀之功。現(xiàn)代藥理學研究表明，丹參因含丹參酮類、丹酚酸類、揮發(fā)油類、多糖類和含氮化合物等化學成分，能夠有效發(fā)揮抗凝血、抗炎、抗纖維化作用[18]；白花蛇舌草中富含環(huán)烯醚萜類成分，該類成分亦具有抗炎、抗纖維化的藥理作用[19]；生地黃配伍玄參可明顯降低大鼠血清TNF-α、IL-6 水平[20]；而紅花不僅可以降低血清中LDH、肌酸激酶同工酶活性，還能通過降低IL-6、IL-1β、TNF-α 的水平來改善微循環(huán)[21]；夏枯草提取物亦能通過降低血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和堿性磷酸酶等多種氧化物含量，改善氧化應(yīng)激，減輕炎癥以防止纖維化[22]；白芍具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[23]；而桔梗主要成分桔梗皂苷D[24]、生黃芪[25]、當歸[26]、薄荷[27]以及茵陳[28]均有顯著的抗炎作用。

團隊前期研究已發(fā)現(xiàn)加味丹玄口康可增強ANE誘導(dǎo)大鼠上皮細胞Axin 的表達，降低β-catenin 表達，抑制上皮細胞凋亡，減少核分裂[8]。 KLF4 抑制Wnt/β-catenin 信號通路的表達，加味丹玄口康可增強KLF4 的表達，拮抗檳榔堿對黏膜上皮細胞的細胞毒性，改善細胞活力、增殖能力和細胞形態(tài)[9]。 再者，該復(fù)方主要部分丹玄口康可通過抑制ANE 刺激的膠原合成而阻止OSF 的發(fā)生和形成[10]。

本研究進一步采用加味丹玄口康治療OSF 模型大鼠，通過測定OSF 大鼠張口度和檢測ANE 誘導(dǎo)的OSF 大鼠血清的LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6 及IFN-γ水平，探討加味丹玄口康對OSF 的免疫調(diào)節(jié)作用和抗纖維化作用，進一步明確其免疫調(diào)節(jié)機制。 結(jié)果顯示，模型組大鼠張口度明顯減小（P＜0.05），血清LDH 水平明顯升高（P＜0.05），大鼠頰黏膜上皮層結(jié)構(gòu)紊亂，上皮萎縮，釘突消失，血管數(shù)量明顯減少，血管狹窄或閉塞，固有層和黏膜下層纖維增生，存在炎癥細胞浸潤，提示ANE 誘導(dǎo)OSF 模型成功。 模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 明顯升高，IFN-γ 明顯降低（P＜0.05），證實在ANE 誘導(dǎo)的OSF 大鼠中存在免疫系統(tǒng)功能紊亂。 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平與OSF 指標均呈負相關(guān)（P＜0.01），與血清標志物LDH水平呈高度正相關(guān)（P＜0.01），提示TNF-α、IL-1β、IL-6 在OSF 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，促進纖維化的發(fā)生和發(fā)展。 血清IFN-γ 水平與張口度呈高度正相關(guān)（P＜0.01），與血清LDH 水平呈負相關(guān)（P＜0.01），提示IFN-γ 在OSF 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抗纖維化作用。 加味丹玄口康高劑量組大鼠張口度明顯減?。≒＜0.05），血清標志物LDH 水平顯著降低（P＜0.05），血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著降低（P＜0.05），血清IFN-γ 顯著升高（P＜0.05），大鼠纖維化癥狀和免疫功能得到顯著改善，提示加味丹玄口康可有效減少大鼠血清炎癥因子，有效緩解炎癥反應(yīng)，對ANE 誘導(dǎo)的OSF 有較好的防治作用。 加味丹玄口康中、低劑量組對大鼠纖維化癥狀和免疫功能亦有改善作用（P＜0.05），但不及高劑量組的改善效果（P＜0.05），提示加味丹玄口康對OSF 大鼠的防治作用與劑量有關(guān)，在往后的研究中可單獨選擇高劑量加味丹玄口康進行實驗。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)加味丹玄口康可顯著增加OSF 大鼠張口度，改變OSF 病理形態(tài)，降低血清LDH 水平，能通過降低促纖維化免疫因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的分泌，以及增加抑制纖維化免疫因子IFN-γ 的分泌，影響機體免疫功能，進而改善纖維化癥狀，控制OSF 病情進展。 進一步驗證了加味丹玄口康治療OSF 的療效機制，為加味丹玄口康的臨床應(yīng)用提供新的實驗依據(jù)。