張娟娟，張 曦，楊逸璇，康 慰，謝小麗，朱明芳*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300）

痤瘡是一種毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于年輕人群顏面、胸背等皮脂腺分布豐富的部位。皮脂生成增多，皮脂成分改變等皮脂腺穩(wěn)態(tài)的改變與痤瘡的發(fā)病密切相關(guān)[1]。MENLIK 提出痤瘡是一種發(fā)生于皮脂腺毛囊的代謝綜合征[2]。 飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝改變可促進(jìn)皮脂腺炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而誘導(dǎo)加重痤瘡的發(fā)生[3]。 研究顯示，痤瘡患者的主要體質(zhì)類型為濕熱質(zhì)[4]。 濕熱體質(zhì)者，素體陽熱旺盛，過食肥甘厚味、辛辣炙煿之品，致濕熱內(nèi)蘊(yùn)，循經(jīng)上蒸于顏面；脾胃內(nèi)傷，失于健運(yùn)，濕濁內(nèi)生，郁久化熱，煉津成痰，加上久坐少動(dòng)、憂思煩勞過重，易致氣機(jī)郁滯不暢，肝之疏泄失調(diào)，日久氣郁生瘀，濕熱痰瘀凝滯肌膚而發(fā)痤瘡。 諸因或獨(dú)或合，易成脾胃濕熱、痰瘀阻絡(luò)證[5]。

三仁湯始載于清代吳鞠通《溫病條辨·上焦·濕溫》，由杏仁、飛滑石、白通草、白蔻仁、淡竹葉、厚樸、生薏苡仁、半夏8 味藥組成[6]。 全方化濕于宣暢氣機(jī)之中，清熱于滲利濕濁之間，三焦兼顧，偏重中焦，治則正合痤瘡中焦脾胃濕熱的病因病機(jī)。 三仁湯組方側(cè)重于祛濕之功，化痰之力稍遜，痰和濕屬于一類，故加味三仁湯在此基礎(chǔ)上加一味海藻，取其咸能軟堅(jiān)、消痰散結(jié)兼利水，與方中利濕藥同用，進(jìn)一步加強(qiáng)化痰、除濕的作用；三仁湯用藥多在氣分，加一味郁金引入血分，可活血化瘀、疏肝、降脂[7]。 本課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)， 加味三仁湯內(nèi)服行宣氣化濕、化痰化瘀之功，可有效改善濕熱痰瘀型痤瘡患者面部油脂分泌過多的癥狀。實(shí)驗(yàn)研究表明石榴皮多酚對(duì)金黃地鼠皮脂腺斑的作用機(jī)制可能與其抑制皮脂腺脂質(zhì)合成、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[8-9]。 然而，加味三仁湯與石榴皮多酚乳膏二者合用對(duì)濕熱痰瘀型痤瘡皮脂脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制尚不清楚。

因此，本研究采用非靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)，研究濕熱環(huán)境+肥甘飲食+限制動(dòng)物活動(dòng)空間的復(fù)合因素下內(nèi)服加味三仁湯聯(lián)合外用石榴皮多酚乳膏干預(yù)金黃地鼠后，其皮脂腺斑脂質(zhì)代謝物含量的變化及對(duì)代謝通路的影響，為運(yùn)用中藥內(nèi)外合治治療濕熱痰瘀型痤瘡提供新的研究思路和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雄性金黃地鼠，體質(zhì)量110～130 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。每只分籠圈養(yǎng)于湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SYXXK（湘）2020-0015。 自然飼養(yǎng)環(huán)境：全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水活動(dòng)，12 h 光照及12 h 黑夜，飼養(yǎng)溫度（22±2） ℃，濕度59%～65%。 本研究經(jīng)湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)[審批號(hào)：IACUC-2021（5）037]。

1.2 藥品

加味三仁湯藥材選用中藥顆粒劑，由瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院智能中藥房提供（四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。 姜半夏批號(hào)20090183，濃縮比1∶21，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片21 g；火單苦杏仁批號(hào)20090015，濃縮比1∶12.5，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片12.5 g；生薏苡仁批號(hào)20100043，濃縮比1∶15，1 g配方顆粒相當(dāng)于飲片15 g；滑石批號(hào)20090168，濃縮比1∶11，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片11 g；豆蔻批號(hào)21010128，濃縮比1∶21，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片21 g；姜厚樸批號(hào)20110128，濃縮比1∶21，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片21 g；小通草批號(hào)20080027，濃縮比1∶11，1 g配方顆粒相當(dāng)于飲片11 g；淡竹葉批號(hào)20050118，濃縮比1∶11，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片11 g；海藻批號(hào)20050079，濃縮比1∶21，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片21 g；郁金批號(hào)20030179，濃縮比1∶17，1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片17 g）。 石榴皮多酚乳膏由課題組參考前期研究臨方配制[10]。

1.3 主要儀器與試劑

1.3.1 儀器 超高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：Ultimate 3000）；高分辨質(zhì)譜儀（美國ABSCIEX 公司，型號(hào)：TripleTOF 5600）；離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：Heraeus Frescol17）；純水儀（默克密理博公司，型號(hào)：明澈D24UV）；色譜柱（Waters 科技有限公司，型號(hào)：ACQUITY UPLC）。1.3.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸（美國霍尼韋爾Burdick＆Jackson 公司），有機(jī)溶劑均為分析純、色譜級(jí)。60%石榴皮多酚（西安悅?cè)簧锟萍加邢薰?，批?hào)：20210916）；水包油型乳膏基質(zhì)(鄭州市津北化工有限公司)；高糖高脂飼料（80%全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料+12%豬油+8%蜂蜜）由湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司提供。

2 方法

2.1 藥物的制備

加味三仁湯藥物組成：三仁湯加海藻、郁金。 三仁湯藥物組成參照《溫病條辨》原組成比例，姜半夏、火單苦杏仁各15 g，生薏苡仁、滑石各18 g，豆蔻、姜厚樸、小通草、淡竹葉各6 g，加海藻15 g、郁金12 g。1劑中藥配方顆粒的重量為759 mg （60 kg 體質(zhì)量成人的每日用量），參考《人類疾病動(dòng)物模型》[11]中動(dòng)物模型藥物劑量的換算方法，確定金黃地鼠日給藥量680 mg·kg-1。每次使用前將其用蒸餾水溫水配制成混懸液。

石榴皮多酚乳膏：參考課題組前期研究結(jié)果[10]，配成10%石榴皮多酚乳膏[0.32 g 生藥/(kg·d)，通過體表面積換算[12]，相當(dāng)于等效劑量的2 倍]。 將棕紅色的石榴皮多酚粉末溶于少量水中， 再加入至水包油型乳膏基質(zhì)中，配成10%的濃度。 每天上午配制1次，供當(dāng)日上午和下午使用，10 h 內(nèi)用完。

2.2 濕熱痰瘀型金黃地鼠痤瘡動(dòng)物模型的建立

以國內(nèi)外公認(rèn)的可作為研究藥物抗皮脂腺增生活性的金黃地鼠兩側(cè)側(cè)腹部皮脂腺斑為痤瘡動(dòng)物模型[13]，通過復(fù)合因素（外部濕熱環(huán)境+肥甘飲食+限制動(dòng)物活動(dòng)空間）模擬痤瘡患者進(jìn)食肥甘厚味、久坐少動(dòng)等不良的生活方式，構(gòu)建濕熱痰瘀型痤瘡動(dòng)物模型[14-15]。 具體方法如下：動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后開始造模，造模前禁食12 h，自由飲水活動(dòng)。 肥甘飲食飼料喂養(yǎng)10 d，每天上午9:00 至11:00 將動(dòng)物置于仿真模擬氣候倉[環(huán)境設(shè)置為：溫度(33±2) ℃，相對(duì)濕度70%～80%]，共18 d，整個(gè)造模期間每天下午1:00 至6:00 限制金黃地鼠活動(dòng)空間（模擬少動(dòng)）。 第19 天上午9:00 移出置于自然飼養(yǎng)環(huán)境。經(jīng)上述造模干預(yù)，金黃地鼠毛發(fā)濕潤雜亂，小便量偏多色黃，異味明顯，大便溏或質(zhì)稠，墊料餿臭。另外，通過金黃地鼠目內(nèi)眥取血并進(jìn)行檢測(cè)，與正常飼養(yǎng)的金黃地鼠比較，結(jié)果顯示造模金黃地鼠低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、甘油三酯（triglyceride, TG）、膽固醇（cholesterol, CHO）指標(biāo)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高密度膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）指標(biāo)變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功。 詳見表1。

表1 兩組動(dòng)物L(fēng)DL-C、TG、CHO、HDL-C 比較（mmol/L，±s）

表1 兩組動(dòng)物L(fēng)DL-C、TG、CHO、HDL-C 比較（mmol/L，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別正常對(duì)照組造模組n 55 LDL-C 0.94±0.11 2.31±0.49*TG 1.92±0.47 3.49±1.35*CHO 3.94±0.39 5.72±0.56*HDL-C 2.51±0.34 2.91±0.19

2.3 動(dòng)物分組與給藥

造模成功后，采用2×2 析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)將32 只動(dòng)物隨機(jī)分成4 組，每組8 只，分別為模型組、中藥外治組、中藥內(nèi)服組、中藥內(nèi)外合治組，依次給予生理鹽水（相同給藥體量）灌胃、外用10%石榴皮多酚乳膏于兩側(cè)皮脂腺斑（每側(cè)1 mL/次）、加味三仁湯灌胃（680 mg·kg-1地鼠體質(zhì)量）、加味三仁湯灌胃聯(lián)合外用10%石榴皮多酚乳膏（方法、給藥量與外治組、內(nèi)服組相同），2 次/d，療程14 d。

2.4 皮脂腺斑總面積測(cè)量

每天觀察各組動(dòng)物的精神狀況、皮毛、活動(dòng)狀態(tài)、二便情況。 給藥前及末次給藥24 h 后，金黃地鼠取仰臥位，剃毛后暴露兩側(cè)皮脂腺斑，強(qiáng)光照射下用照相機(jī)以同一焦距記錄皮脂腺斑大體照片，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄左右兩側(cè)皮脂腺斑的最大橫徑（transverse diameter, TD）、最大縱徑（longitudinal diameter, LD），計(jì)算兩側(cè)皮脂腺斑總面積（DT×DL）之和。

2.5 皮脂腺斑組織形態(tài)病理變化觀察

末次用藥后24 h，取金黃地鼠左側(cè)皮脂腺斑組織，置于10%甲醛固定液中固定待檢。經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察各組組織病理學(xué)變化。

2.6 皮脂腺斑樣本預(yù)處理方法

取模型組、中藥內(nèi)外合治組2 組右側(cè)皮脂腺斑樣本，每組6 份生物學(xué)重復(fù)樣本進(jìn)行非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。 非靶向脂質(zhì)代謝物的提?。海?） 稱取200 mg的組織樣品，進(jìn)行液氮研磨；（2）向每個(gè)樣品加入120 μL 50%甲醇，震動(dòng)充分混勻，提取樣品中的脂質(zhì)，常溫靜置10 min；（3）提取液放-20 ℃過夜，沉淀樣品中的蛋白質(zhì)；（4）離心20 min（4000 r/min），轉(zhuǎn)移上清液脂質(zhì)提取液到96 孔板；（5）樣品利用稀釋液（異丙醇∶乙腈∶水=2∶1∶1，體積比）稀釋脂質(zhì)提取液；（6）每個(gè)樣品等量取出10 μL 稀釋液混合成QC樣品；（7）所有代謝樣品在上樣前放-80 ℃冰箱保存。

2.7 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件： 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃，流速為0.4 mL/min。 流動(dòng)相為溶劑A（含0.1%甲酸的水）和溶劑B（含0.1%甲酸的乙腈）。 液相梯度設(shè)置為：0～0.5 min，5% B；0.5 ～7.0 min，5%～100% B；7.0 ～8.0 min，100% B；8.0 ～8.1 min，100%～5% B；8.1～10.0 min，5% B。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源，正、負(fù)離子采集模式。 離子源的遮蔽氣壓30 psi，輔氣、鞘氣壓60 psi。 源溫度650 ℃。電壓設(shè)置：正離子5 kV，負(fù)離子-4.5 kV。信息依賴性模式采集數(shù)據(jù)。 采用2 組樣本一一對(duì)應(yīng)的方法進(jìn)行樣本的連續(xù)分析，在樣本采集開始、每間隔6 個(gè)樣本、樣本采集結(jié)束時(shí)進(jìn)行一次QC 品的掃描。用QC 間的質(zhì)量差距來校正整批實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差。

2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)MSConvert 軟件轉(zhuǎn)換為mzXML 格式，利用xcms 軟件進(jìn)行峰提取、保留時(shí)間矯正。使用基于R 語言的metaX 將Compound Discoverer 3.1.0導(dǎo)出的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化、峰提取和過濾、樣本保留時(shí)間對(duì)齊、加合離子合并、缺失值填充等處理。 結(jié)合HMDB、KEGG、LipidMaps 等多個(gè)數(shù)據(jù)庫得到各個(gè)離子的分子量、保留時(shí)間、峰面積和代謝物鑒定結(jié)果等信息。 將鑒定所得差異代謝物數(shù)據(jù)通過MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行通路富集分析。 差異代謝物的統(tǒng)計(jì)采用單變量分析差異倍數(shù)和Test 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，進(jìn)行BH 校正得到qvalue，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析PLS-DA 得到變量權(quán)重（variable important for the projection, VIP）值，篩選差異表達(dá)的代謝離子，多元統(tǒng)計(jì)分析包括無監(jiān)督主成分分析（PCA）、有監(jiān)督最小二乘法判別分析（PLS-DA）。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，T 檢驗(yàn)分析用于檢測(cè)兩組數(shù)據(jù)間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單因素方差分析用于檢測(cè)3組或以上數(shù)據(jù)間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況

肥甘飼料+濕熱環(huán)境喂養(yǎng)下，金黃地鼠開始出現(xiàn)小便量多、色黃、異味大等“濕熱”表現(xiàn)，伴隨毛發(fā)潮濕油膩，呈雜亂狀，大便便溏或黏稠色暗，墊料餿臭等“痰濕”癥狀，造模后期限制動(dòng)物活動(dòng)空間后，金黃地鼠出現(xiàn)體形較肥胖，懶動(dòng)，精神低靡，喜蜷縮，進(jìn)食減少等典型“濕熱痰瘀”表現(xiàn)。與模型組、中藥外治組相比，中藥內(nèi)服組和中藥內(nèi)外合治組金黃地鼠毛發(fā)油膩程度好轉(zhuǎn)，小便異味減少，大便稀溏程度減輕。

3.2 皮脂腺斑總面積比較

給藥前，各組金黃地鼠皮脂腺斑總面積大小比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 給藥后，中藥內(nèi)服組金黃地鼠皮脂腺斑總面積減小，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中藥外治組和中藥內(nèi)外合治組金黃地鼠皮脂腺斑總面積均明顯減小，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2、圖1。

圖1 治療后各組金黃地鼠皮脂腺斑大體圖

表2 給藥前后兩側(cè)皮脂腺斑面積比較（mm2，±s）

表2 給藥前后兩側(cè)皮脂腺斑面積比較（mm2，±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05。

組別 n 皮脂腺斑總面積給藥前 給藥后模型組中藥外治組中藥內(nèi)服組中藥內(nèi)外合治組F 值P 值8 88 8 76.96±16.48 74.55±5.85 72.66±9.59 73.47±6.61 0.316 0.814 30.39±7.15 23.70±3.85*26.37±3.48 23.58±3.88*3.506 0.028

3.3 皮脂腺斑組織病理學(xué)觀察

模型組皮脂腺腺體飽滿，體積較大，腺葉數(shù)目較多，排列緊密整齊；中藥外治組皮脂腺腺體變小，厚度變薄，重疊腺葉數(shù)減少，排列松散；中藥內(nèi)服組多數(shù)皮脂腺腺體厚度變薄，排列松散；中藥內(nèi)外合治組皮脂腺腺體明顯變小，厚度明顯變薄，數(shù)目明顯減少，部分腺小葉中心區(qū)見崩解的無定形脂質(zhì)團(tuán)塊向皮膚表面移位，腺體周圍炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，中藥內(nèi)外合治組皮脂腺斑顯微結(jié)構(gòu)變化最明顯，故取模型組與中藥內(nèi)外合治組皮脂腺斑樣本進(jìn)一步行非靶向脂質(zhì)組學(xué)研究。 詳見圖2。

圖2 各組金黃地鼠皮脂腺斑病理變化（HE，×40）

3.4 皮脂腺斑代謝組學(xué)多元化分析

3.4.1 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制 將分析得到的QC 樣本基峰色譜圖（base peak chromatogram, BPC）進(jìn)行譜圖重疊比較，總離子流圖（total ion chromatogram, TIC）顯示樣本的色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，重復(fù)性好，表明本實(shí)驗(yàn)的儀器、數(shù)據(jù)可靠性和穩(wěn)定性良好。 詳見圖3。

圖3 QC 樣本總離子流圖

3.4.2 代謝輪廓分析 篩選出的差異代謝物進(jìn)行PCA，見圖4，在PCA 得分圖中，圖4A 顯示QC 樣本（藍(lán)色）在圖中原點(diǎn)附近緊密聚合，說明檢測(cè)穩(wěn)定。圖4B 顯示模型組和中藥內(nèi)外合治組聚類情況良好，僅有個(gè)別離散值，表明兩組數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，所得差異物能反映樣本間的生物學(xué)差異。

在PCA 基礎(chǔ)上引入有監(jiān)督的差異辨別分析方法即PLS-DA 分析，進(jìn)一步觀察兩組間的差異，見圖4C。 兩組樣本間較好分離，表明兩組代謝模式存在差異。 對(duì)模型進(jìn)行200 次隨機(jī)排列組合實(shí)驗(yàn)，得PLS-DA 模型的置換檢驗(yàn)圖，見圖4D。 結(jié)果顯示模型不存在過擬合情況，表明模型存在且可靠，可用于后續(xù)進(jìn)一步模型差異代謝物的篩選。

圖4 兩組樣本代謝輪廓圖

3.4.3 代謝物定量 熱圖展示不同代謝物在樣品間的重復(fù)性即聚類情況。 圖5A 按照表達(dá)量的信息進(jìn)行聚類，顯示同組樣本聚合良好，圖5B 說明造模及給藥過程中代謝物脂類的脂肪酸（fatty acids, FA）、甘油酯（glycerolipids, GL）、甘油磷脂（glycerophospholipids, GP）、孕烯醇酮脂（prenol lipids, PR）、鞘脂（sphingolipids, SP）、固醇脂（sterol lipids, ST）的變化模式。

圖5 二級(jí)代謝物鑒定的熱圖

3.4.4 差異代謝物篩選 在兩組對(duì)比所得的共同差異代謝物中，共鑒定出13 個(gè)與金黃地鼠皮脂腺斑脂質(zhì)代謝相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，為二?；视推咸烟侨┧彳眨╠iacylglyceryl glucuronide, DGGA）、溶血磷脂酰膽堿（lysophophatidylcholine, LPC[42:5-SN2]）、己糖神經(jīng)酰胺及其硫苷脂（SHexCers）、卵磷脂（phosphatidylcholine, PC）、神經(jīng)酰胺（ceramides, Cer）、二酰甘油酯（diacylglycerol, DG）、磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）、磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol, PI）、鞘氨醇（sphingoid base, SPB）、鞘磷脂（sphingomyelin, SM）、TG、心磷脂（cardiolipin, CL）、溶血磷脂酰膽堿（lysophophatidylcholine, LPC[40:11-SN2]），詳見圖6。 正、負(fù)離子模式下，以變異倍數(shù)分析（fold change analysis, FC）值≥1.8 或≤0.5，注：1M.模型組；4M.中藥內(nèi)外合治組；A.兩組樣本聚類情況；B.兩組樣本代謝物脂類的變化模式。 圖中不同顏色表示強(qiáng)度袁顏色從藍(lán)色到紅色表示強(qiáng)度由低到高。VIP 值＞1 和P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，比較兩組皮脂腺斑脂質(zhì)的整體差異表達(dá)倍數(shù)情況。 與模型組比較，中藥內(nèi)外合治組差異倍數(shù)最大且顯著相關(guān)的主要脂質(zhì)成分是SM、SHexCer、CL、SPB、Cer、DG、TG、PS、LPC、PI。 詳見表3。

表3 模型組和中藥內(nèi)外合治組差異脂質(zhì)成分分析

圖6 兩組樣本差異二級(jí)代謝物熱圖

3.4.5 代謝通路分析 根據(jù)差異代謝物結(jié)果，采用ggplot2 對(duì)KEGG 通路富集。 KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)代謝途徑相關(guān)通路占主導(dǎo)地位，其他涉及細(xì)胞過程相關(guān)通路、環(huán)境信息處理相關(guān)通路、人類疾病相關(guān)通路、器官系統(tǒng)相關(guān)通路。 代謝途徑相關(guān)通路的脂質(zhì)代謝通路富集分析結(jié)果顯示，經(jīng)中藥內(nèi)外合治干預(yù)后，對(duì)差異代謝物影響顯著的代謝通路為亞油酸代謝、GL 代謝、花生四烯酸代謝、α-亞麻酸代謝，影響不顯著的代謝通路是SP、GP 代謝。 詳見圖7。

圖7 差異代謝物KEGG 通路富集圖

4 討論

痤瘡病因復(fù)雜，多采用綜合手段治療。 皮脂脂質(zhì)代謝紊亂或許是導(dǎo)致痤瘡發(fā)生的主要原因，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)改善皮脂代謝通常使用維甲酸類、性激素等藥物，其生殖毒性、肝功能損害、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)發(fā)生率高，迫使很多患者尋求中醫(yī)藥治療。 多項(xiàng)研究結(jié)果表明，三仁湯及三仁湯加減方具有很好的調(diào)脂、改善脂代謝紊亂的作用[16-19]。 外用石榴皮多酚乳膏直達(dá)病所，經(jīng)皮吸收，抑制皮脂分泌[20]。 故本研究從改善皮脂脂質(zhì)代謝角度出發(fā)，觀察加味三仁湯聯(lián)合石榴皮多酚乳膏內(nèi)外合治對(duì)濕熱痰瘀型金黃地鼠痤瘡模型一般狀況、皮脂腺斑總面積及組織病理學(xué)變化的影響。經(jīng)中藥內(nèi)外合治后，金黃地鼠相關(guān)代謝紊亂情況改善。與模型組相比，中藥外治、中藥內(nèi)外合治均能使皮脂腺斑總面積縮小，有效抗皮脂腺斑增生。組織病理學(xué)顯示，二者內(nèi)外合治后，濕熱痰瘀型金黃地鼠皮脂腺斑腺體變小、厚度變薄、數(shù)目減少，腺小葉中心區(qū)無定形的脂質(zhì)團(tuán)塊逐漸向皮膚表面移位，組織結(jié)構(gòu)改善最明顯。

皮脂成分種類繁多，結(jié)構(gòu)變化多端，很多分析皮脂的方法都有一定的局限性。 脂質(zhì)代謝組學(xué)分析技術(shù)可從整體角度認(rèn)知痤瘡皮脂脂質(zhì)含量及成分改變，評(píng)估皮膚脂質(zhì)屏障功能，為監(jiān)測(cè)皮脂穩(wěn)態(tài)在痤瘡發(fā)生發(fā)展及治療中的作用提供新的思路。 我們采用非靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)分析加味三仁湯聯(lián)合石榴皮多酚乳膏內(nèi)外合治干預(yù)濕熱痰瘀型金黃地鼠痤瘡模型，旨在發(fā)現(xiàn)內(nèi)外結(jié)合治療共同發(fā)揮作用機(jī)制的可能作用代謝產(chǎn)物，為使用內(nèi)外合治綜合治療手段治療濕熱痰瘀型痤瘡提供有力的科學(xué)證據(jù)。

皮脂主要由皮脂腺分泌和排泄。 它是一種混合物，其中包含有多種脂類物質(zhì)，主要有飽和及不飽和游離脂肪酸、甘油酯類、蠟酯類、固醇類、角鯊烯及神經(jīng)酰胺等[21-22]。 一項(xiàng)對(duì)青年男性痤瘡患者的皮脂分析研究顯示，甘油磷脂類、脂肪酸類、固醇類含量顯著升高，孕烯醇酮脂類和糖脂類含量降低[23]。從輕度到中度青春期痤瘡，TG、DG、FA、Cer 的相對(duì)平均含量及不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid, UFA）水平顯著升高。 同時(shí)，TG、UFA、Cer 含量與痤瘡嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系[24]。 另一項(xiàng)利用脂質(zhì)組學(xué)研究青少年痤瘡皮脂功能紊亂的研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡患者皮脂中含有豐富的甘油二酯，其次是脂肪酰類、固醇脂類，且皮脂成分紊亂程度與痤瘡嚴(yán)重度呈正相關(guān)[25]。

本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從整體角度發(fā)現(xiàn)，加味三仁湯聯(lián)合石榴皮多酚乳膏的內(nèi)外合治手段對(duì)濕熱痰瘀型痤瘡動(dòng)物模型的作用機(jī)制主要通過調(diào)節(jié)皮脂亞油酸代謝、甘油酯代謝、花生四烯酸代謝、α-亞麻酸代謝，從而影響脂肪酸類、甘油酯含量的表達(dá)，發(fā)揮治療痤瘡的作用。