楊家發(fā)，朱義通，陸兆豐，王亞瓊，陸若玉，李海榮，劉夢佳

(1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院 河南 洛陽 471003；2.上海交通大學 公共衛(wèi)生學院，上海 200001)

創(chuàng)傷性腦損傷是死亡和殘疾的主要原因之一，是一個國際公共衛(wèi)生問題[1]。為了深入了解腦外傷的機理，研究人員已經(jīng)建立了一些實驗動物模型，自由落體誘導的創(chuàng)傷性腦損傷模型可以產(chǎn)生分級腦損傷和誘發(fā)神經(jīng)行為缺陷，并可能與開發(fā)創(chuàng)傷性腦損傷的治療策略有轉(zhuǎn)化相關性[2]。血腦屏障的測量對于研究血腦屏障功能障礙或破壞與腦障礙發(fā)病機制之間的相互作用具有重要意義。應采用適當?shù)姆椒ㄑ芯垦X屏障的完整性。示蹤劑、血漿蛋白、緊密連接蛋白和成像模式可用于檢測血腦屏障的通透性[3-4]。

在腦組織病理學實驗研究中，需在體心臟灌注固定腦組織，實驗動物在體心臟灌注被廣泛應用于組織固定，心臟灌流術能夠快速沖凈血液并在動物死亡前進行組織的前固定，避免了組織的自溶現(xiàn)象，是腦組織切片觀察的常用方法。多聚甲醛使組織蛋白發(fā)生交聯(lián)，以保持蛋白的原位和表面結(jié)構不變，從而能使其對應的抗體準確檢測其表達位置和量。因此，本研究擬建立閉合性中等程度腦損傷動物模型，通過股動靜脈穿刺置管靜脈注射伊文斯蘭染色，暴露胸腔，同時夾閉下腔動靜脈腹主動脈，行左心室心臟灌流，探討動靜脈夾閉在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織在體心臟灌流固定術中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組36只4月齡無特定病原級雄性Sprague Dawley大鼠購自河南科技大學實驗動物中心，體質(zhì)量306～335(320.05±11.14)g；隨機分為對照組及實驗組，每組18只，飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替環(huán)境，溫度保持在25 ℃；術前12 h禁食，6 h禁水。

1.2 主要試劑及器械肝素(成都市海通藥業(yè)有限公司)，注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(蘇泰?50)(上?；瘜W試劑分裝廠)，40 g·L-1多聚甲醛灌注液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，9 g·L-1氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，帶有LED燈普通放大鏡(浙江安普機械有限公司)，24G針管回縮式靜脈留置針(24G×19 mm，山東威海銳捷醫(yī)用制品有限公司)。腦立體定位儀(深圳瑞沃德雙臂/大鼠/68078/18度耳桿)，環(huán)鉆(江蘇賽德器械有限公司)。

1.3 麻醉及創(chuàng)傷性腦損傷模型實驗時用注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(蘇泰?50)50 mg·kg-1腹腔注射后俯臥于腦立體定位儀上，頸部墊圓柱形海綿墊抬升頭部確保頂骨充分暴露。固定后額頂部剃毛、消毒，鋪手術創(chuàng)巾，正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨，用環(huán)鉆在冠狀縫后1.5 mm，中線旁2.5 mm處鉆一直徑7 mm骨窗，保持硬腦膜完整。將直徑6 mm 3.5 g鋼棒從滴定管架固定內(nèi)徑7 mm聚氯乙烯透明管70 cm自由下落，撞擊硬腦膜致中度腦挫裂傷，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。建模成功后用電熱毯維持大鼠肛溫于(36.5±0.5)℃。放籠飼養(yǎng)。

1.4 股靜脈穿刺置管建模24 h后注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(蘇泰?50)50 mg·kg-1腹腔注射后仰臥于顯微實驗臺上，剃去腿部內(nèi)側(cè)區(qū)域的毛發(fā)，使用醫(yī)用碘伏擦洗，擦洗從中心開始的剃光的手術區(qū)域，并向外進行圓形消毒。對每個區(qū)域重復3次。左側(cè)腹股溝中外1/3與股靜脈交叉口外1 cm平行股鞘切開皮膚，鈍性分離筋膜，顯露股靜脈，在LED放大鏡下，用24G針管回縮式靜脈留置針穿刺，回抽，見回血后，肝素注射，回抽；對照組用24G針管回縮式靜脈留置針穿刺，步驟與對照組相同。

1.5 心臟灌流固定術對照組和實驗組24 h后股靜脈穿刺注射20 g·L-1伊文斯蘭3 mL·kg-1，術后1 h在麻醉狀態(tài)下暴露胸腔，剪開心包，在左心室剪開小口，插入灌流針并固定，實驗組同時夾閉下腔動靜脈腹主動脈，同時在右心耳剪開小口，對照組和實驗組左心室灌注9 g·L-1氯化鈉注射液，直至右心耳流出液清亮為止，以清除血液中染料，對照組和實驗組緩慢灌注40 g·L-1多聚甲醛，斷頭取腦迅速浸入體積分數(shù)為10%的甲醛溶液150 mL固定1 h，石蠟包埋，行5 μm冠狀切片，進行HE染色及免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 灌注成功指標前肢、后肢、腹部、尾部肌肉劇烈抽動；肝臟、眼珠、爪子迅速變白(實驗組肝臟藍染)；右心耳流出液體藍色較淺基本清亮。

2.2 固定成功指標前肢、頸部、脊柱、尾部僵硬；灌注的腦組織白而硬(實驗組損傷區(qū)藍染)。灌注或固定不足在病理切片表現(xiàn)為組織疏松，鏡下組織分離，容易產(chǎn)生破片、脫片。

2.3 統(tǒng)計學指標選取股靜脈穿刺置管成功大鼠靜脈注射伊文斯蘭，實驗組及對照組股靜脈穿刺置管成功15只，行腦組織灌注固定，實驗組和對照組灌注成功率分別為93.33%(14/15)和80.00%(12/15)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.042)。見表1。

表1 兩組統(tǒng)計指標

2.4 灌流固定腦組織HE和免疫組化染色觀察HE染色：不同程度基質(zhì)疏松，細胞周圍間隙和血管周間隙輕度擴大，星形膠質(zhì)細胞腫大，神經(jīng)元核固縮、胞體收縮呈三角形，胞質(zhì)嗜色性減弱，核皺縮濃染(圖1)。免疫組化染色：β-淀粉樣前體蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白在神經(jīng)元漿膜下和(或)軸突處積累，免疫組織化學染色呈棕染。

A為實驗組，B為對照組。彌漫性出血性改變，神經(jīng)元體積?？s小，胞膜與周圍無明顯分界，胞核固縮，正常結(jié)構及核仁皆消失。

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷是造成死亡、殘疾和精神健康障礙的主要原因之一。大多數(shù)創(chuàng)傷性腦損傷患者有長期創(chuàng)傷后應激障礙、認知障礙和殘疾。這種神經(jīng)病理進展的潛在分子和細胞機制仍不清楚。各種腦外傷動物模型對輕、中、重度損傷的分類界限不清與創(chuàng)傷性腦損傷異質(zhì)性有關。因此，更好的診斷和治療需要更好地理解不同模型中明確的輕、中、重度損傷的損傷機制，這些模型可能反映了不同類型的人類腦損傷。局灶性損傷是一種局域性損傷，表現(xiàn)為控制性皮層損傷、彈道穿透性腦損傷和Feeney或Shohami自由落體損傷等動物模型[5]。大鼠自由落體損傷模型模擬了人類嚴重創(chuàng)傷性腦損傷引起的彌漫性軸索損傷(difffuse axonal injury，DAI)。重度控制性皮質(zhì)撞擊模型的運動功能障礙更為嚴重，重度自由體質(zhì)量下降模型的認知障礙更為嚴重。與重度自由體質(zhì)量下降組相比，重度對照皮質(zhì)撞擊組的腦水腫、炎癥細胞因子改變和皮層神經(jīng)元凋亡更為明顯，血腦屏障損傷更為局灶性[6]。而組織灌注固定的質(zhì)量決定了DAI抗體準確檢測其表達位置和量。

創(chuàng)傷性腦損傷動物模型建立和應用研究中，尚缺乏統(tǒng)一的、與臨床創(chuàng)傷性腦損傷患者格拉斯哥昏迷量表或格拉斯哥預后評分類似的量化評分系統(tǒng)，以評估動物創(chuàng)傷性腦損傷后損傷程度及預后評估，部分學者通過結(jié)合傷后大鼠血清中腦損傷標志物評估腦損傷程度[7]。通過腦血管系統(tǒng)灌注固定劑是動物準備腦組織用于空間生物分子譜、回路追蹤和超微結(jié)構研究(如連接組學)的金標準方法。腦灌注固定已經(jīng)在動物模型中進行了幾十年，作為一種更穩(wěn)健和可靠的方式保持組織完整性的方法。人類腦組織灌注固定方法的改進將使人類大腦疾病病理生理學的新研究成為可能，如高分辨率的體外神經(jīng)成像、空間生物分子圖譜、回路追蹤和連接體研究。灌注固定是一種適用于更高質(zhì)量的深部結(jié)構固定和可能提高免疫原性的方法[8]。

通過循環(huán)系統(tǒng)直接灌注固定劑的優(yōu)點是這種化學物質(zhì)可以利用天然的血管網(wǎng)絡迅速到達生物體的每一個角落。灌注固定的技術取決于要固定的組織以及固定后組織的處理方式。低成本、快速、可控和統(tǒng)一的固定過程，使用40 g·L-1多聚甲醛通過血管系統(tǒng)灌注：通過大鼠的心臟，以獲得免疫組化中大腦的最佳保存。這種技術的主要優(yōu)勢(與重力輸送系統(tǒng)相比)是循環(huán)系統(tǒng)被最有效地利用[9]。

最適灌注壓影響灌注固定保存的腦組織中血管和組織的完整性[10-12]。在保證最適灌注壓基礎上，減少不必要灌注容積，既可以提高灌注成功率，又可以縮短灌注固定時間，為建立穩(wěn)定可靠、簡便易行、可重復性的創(chuàng)傷性顱腦損傷動物模型奠定基礎。研究顯示大鼠上肢及頸部循環(huán)在腦灌注固定中占據(jù)重要作用，下肢及腹腔循環(huán)夾閉后，效果明顯，通過股靜脈穿刺，靜脈注射伊文斯蘭，上肢及下肢經(jīng)灌注后，相較傳統(tǒng)無染色灌注，效果差異明顯，腦組織病理結(jié)果是評價灌注固定效果及其染色效果的一項指標。夾閉法相較傳統(tǒng)灌注固定法優(yōu)點在于：(1)操作簡單，手術時間短，常規(guī)暴露心臟，提起心包外膜，止血鉗夾閉下腔動靜脈，在心尖搏動點剪開小口，插入改進型灌胃器，固定，即可灌注；(2)灌注壓相對低，手術保留頭頸部及前肢動靜脈系統(tǒng)，去除下腔動靜脈系統(tǒng)，較低的灌注壓即可達到效果；(3)適用于大動物模型，大動物臟器相較大鼠解剖標志模型，夾閉法仍然適用。

總之，動靜脈夾閉在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織固定中能提高灌注成功率，縮短灌注時間，節(jié)約試劑，且可以取得與傳統(tǒng)方法固定腦組織相同的良好效果，值得推廣應用。