李耿章，符文紅，楊馮睿

(1.邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南邵陽 422001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽 421001)

神經(jīng)病理性疼痛(NP)是臨床難治性疾病，杏仁核活動(dòng)與疼痛行為密切相關(guān)[1-2]，抑制杏仁核活動(dòng)可緩解NP[3]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在調(diào)控長時(shí)程突觸可塑性上發(fā)揮重要作用[4]。mTOR及其下游效應(yīng)物被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于疼痛處理主要區(qū)域的脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和脊髓背角，有助于傷害性信息的傳遞和調(diào)制。研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，可在神經(jīng)損傷后的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中持續(xù)活化，而JNK抑制劑SP600125可改善脊髓損傷后的NP癥狀[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)參與NP狀態(tài)下杏仁核功能異常，然而，NP狀態(tài)下杏仁核中mTOR和JNK表達(dá)的變化及其與MCP-1關(guān)系尚不清楚，故本研究將進(jìn)行初步探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑

兔抗MCP-1單克隆抗體(批號：sc-4906，美國Santa Cruz公司)，磷酸化mTOR(p-mTOR)多克隆抗體(批號：ab45989，美國Abcam公司)，磷酸化JNK (p-JNK) 單克隆抗體(批號：ab124954， 美國Abcam公司)，mTOR抑制劑雷帕霉素(批號：HY-10219，美國MCE公司)，JNK抑制劑SP600125(批號：420119-5MG，德國Merck公司)，MCP-1 ELISA試劑盒(美國RD公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取2月齡200～260 g雄性SD大鼠96只，采用左側(cè)第5/6腰椎(L5/6)脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)制備NP模型。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)部分：(1)將24只大鼠于SNL術(shù)前及術(shù)后第7、14和21天(d0、d7、d14和d21，各6只)取杏仁核，采用Western blot檢測p-mTOR、p-JNK表達(dá)情況并分析二者與MCP-1水平的相關(guān)性；(2)48只NP模型大鼠雙側(cè)杏仁核注射不同濃度mTOR抑制劑雷帕霉素(0、0.1、1.0和10.0 μmol/L)或JNK抑制劑SP600125(0、0.1、1.0和10.0 μmol/L)，于術(shù)后21 d(每個(gè)濃度各6只)取杏仁核，采用ELISA檢測MCP-1水平，免疫組織化學(xué)法檢測MCP-1陽性細(xì)胞數(shù)；(3)24只大鼠分為3組，即假手術(shù)組(僅暴露脊神經(jīng)而不結(jié)扎)、模型組及抑制劑組(雙側(cè)杏仁核注射10 μmol/L SP600125或雷帕霉素3 μL)，于d0、d4、d7、d14、d21共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定各組機(jī)械痛閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。本實(shí)驗(yàn)所用大鼠購自上海斯萊克公司，飼養(yǎng)于無特殊病原體(SPF)級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，明暗時(shí)間設(shè)定為12 h∶12 h，保持室溫20～22 ℃，濕度60%～70%。

1.2 方法

1.2.1NP模型制備

采用左側(cè)L5/6 SNL制備NP模型，簡述如下：經(jīng)50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，俯臥位固定在顯微外科裝置下，取后正中切口暴露第4腰椎(L4)至第3骶椎(S3)的棘突和椎板，小心地移除左側(cè)L6橫突，分離左側(cè)L5和L6脊神經(jīng)并結(jié)扎，隨后采用6-0絲線連續(xù)縫合肌肉和皮膚切口。假手術(shù)組大鼠僅暴露L5和L6脊神經(jīng)，但不結(jié)扎。所有大鼠均給予連續(xù)5 d青霉素腹腔注射(20萬U/d)。剔除術(shù)后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的大鼠。

1.2.2杏仁核p-mTOR、p-JNK水平檢測

分別于d0、d7、d14、d21將大鼠過量麻醉致死，斷頭取腦，液氮速凍，迅速取出杏仁核，研磨至勻漿，蛋白裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，然后采用Western blot檢測提取的蛋白水平。具體操作如下：每組提取等量蛋白(添加適量的上樣緩沖液)，水浴鍋加熱使蛋白變性，將處理好的蛋白樣品(每個(gè)膠孔上樣量為20 μL左右)進(jìn)行常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯((PVDF)膜。將膜放置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，之后用配制好的p-mTOR、p-JNK一抗(稀釋比為1︰1 000)在4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天加入二抗室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液顯色，并使用凝膠成像設(shè)備進(jìn)行結(jié)果觀察和拍照存檔。

1.2.3杏仁核MCP-1水平檢測

于術(shù)后21 d取制備好的杏仁核勻漿液，采用ELISA試劑盒檢測MCP-1水平。操作步驟嚴(yán)格遵循試劑盒說明書，在450 nm波長下采用ELx800型酶標(biāo)儀檢測吸光度(A450)值。

1.2.4杏仁核MCP-1陽性細(xì)胞數(shù)檢測

于d21將大鼠過量麻醉致死，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注4%多聚甲醛500 mL，迅速取出杏仁核，經(jīng)包埋劑處理后，以20 μm厚度行橫向冰凍切片，直接轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的顯微鏡載玻片，經(jīng)煮沸的檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)和3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性后，采用稀釋比例為1∶200的MCP-1過夜孵育。經(jīng)相應(yīng)二抗處理后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，再經(jīng)過蘇木素復(fù)染，鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5MWT測定

分別于d0、d4、d7、d14、d21測定各組大鼠的MWT。所有的行為測試均在9：00—14:00進(jìn)行。MWT參照文獻(xiàn)[7]采用序貫法進(jìn)行測定。將大鼠置于透明的塑料盒中適應(yīng)至少30 min，采用0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和15.0 g的von Frey纖維絲，初始刺激為2.0 g，垂直刺激左后足跖面，以細(xì)絲稍彎曲作為完全受力的標(biāo)準(zhǔn)，每次持續(xù)6 s。當(dāng)出現(xiàn)左后爪急劇縮回或細(xì)絲移開立即退縮為陽性反應(yīng)，依次增加和減少刺激強(qiáng)度，直至出現(xiàn)第1次陽性和陰性(或陰性和陽性)反應(yīng)的騎跨，再向下連續(xù)測定4次。不同刺激之間相隔30 s，以消除前一刺激的影響。最后計(jì)算誘發(fā)50%大鼠縮足反應(yīng)的刺激強(qiáng)度即MWT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SNL后不同時(shí)間點(diǎn)p-mTOR水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，與d0相比，d7、d14、d21NP模型大鼠杏仁核中p-mTOR水平升高(P<0.05)，且d21水平最高；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，d21的大鼠杏仁核p-mTOR水平與MCP-1水平呈正相關(guān)(r=0.629，P<0.05)，見圖1。

2.2 SNL后不同時(shí)間點(diǎn)p-JNK水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，與d0相比，d7、d14、d21NP模型大鼠杏仁核中p-JNK水平升高(P<0.05)，且d21水平最高；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，d21的大鼠杏仁核p-JNK水平與MCP-1水平呈正相關(guān)(r=0.564，P<0.05)，見圖2。

2.3 杏仁核注射SP600125對MCP-1表達(dá)的影響

與0 μmol/L組相比，0.1、1.0、10.0 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細(xì)胞數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且10.0 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細(xì)胞數(shù)最低，見圖3、4。

2.4 杏仁核注射雷帕霉素對MCP-1表達(dá)的影響

與0 μmol/L組相比，0.1、1.0、10.0 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細(xì)胞數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且10 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細(xì)胞數(shù)最低，見圖5、6。

A：p-mTOR相對表達(dá)水平柱狀圖；B：p-mTOR水平與MCP-1水平的相關(guān)性分析；C：p-mTOR與MCP-1的蛋白電泳條帶；a:P<0.05,與d0比較。

A：p-JNK相對表達(dá)水平柱狀圖；B：p-JNK水平與MCP-1水平的相關(guān)性分析；C：p-JNK與MCP-1的蛋白電泳條帶；a:P<0.05,與d0比較。

A：0 μmol/L組；B：0.1 μmol/L組；C：1.0 μmol/L組；D：10.0 μmol/L組。

A：MCP-1水平柱狀圖；B：MCP-1陽性細(xì)胞數(shù)柱狀圖；a:P<0.05，與0 μmol/L比較。

2.5 杏仁核注射SP600125對MWT的影響

假手術(shù)組、模型組和SP600125組大鼠d0MWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；假手術(shù)組大鼠d0、d4、d7、d14、d21MWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與d0相比，模型組和SP600125組d4、d7、d14、d21的MWT均降低(P<0.05)。模型組d4、d7、d14、d21的MWT均明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；經(jīng)SP600125治療后大鼠降低的MWT獲改善，SP600125組d7、d14、d21的MWT均高于模型組(P<0.05)，但仍低于假手術(shù)組(P<0.05)，見圖7。

A：0 μmol/L組；B：0.1 μmol/L組；C：1.0 μmol/L組；D：10.0 μmol/L組。

2.6 杏仁核注射雷帕霉素對MWT的影響

假手術(shù)組、模型組和雷帕霉素組大鼠d0MWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；假手術(shù)組大鼠d0、d4、d7、d14、d21MWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與d0相比，模型組和雷帕霉素組d4、d7、d14、d21的MWT均降低(P<0.05)。模型組d4、d7、d14、d21的MWT均明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；經(jīng)雷帕霉素治療后大鼠降低的MWT獲改善，雷帕霉素組d7、d14、d21的MWT均高于模型組(P<0.05)，但仍低于假手術(shù)組(P<0.05)，見圖8。

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明，趨化因子MCP-1通過促進(jìn)趨化因子受體2(CCR2)活化在慢性疼痛中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MCP-1在DRG初級感覺神經(jīng)元中表達(dá)，且神經(jīng)損傷后表達(dá)增加[8]。到目前為止，針對產(chǎn)生痛覺過敏已經(jīng)提出兩種不同的機(jī)制：(1)MCP-1從一部分感覺神經(jīng)元的中釋放出來，刺激周圍感覺神經(jīng)元[9]，在DRG中導(dǎo)致這些神經(jīng)元過度活躍。(2)MCP-1在DRG神經(jīng)元中央末端釋放，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，是NP發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[10]。然而，MCP-1不僅在DRG中表達(dá)，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞體外也可產(chǎn)生MCP-1。研究表明，MCP-1在脫髓鞘病變、機(jī)械損傷、軸突橫斷及局灶性腦缺血后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中也表達(dá)[11]。此外，MCP-1在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激后的體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞及脊髓損傷后的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)SNL后，參與調(diào)控NP的重要核團(tuán)杏仁核中的MCP-1水平升高，但導(dǎo)致其MCP-1升高的具體機(jī)制尚不清楚。

目前有兩種mTOR作為核心組分與其他不同蛋白形成的復(fù)合物，包括mTOR復(fù)合物1 (mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)。在一般情況下，mTORC1由raptor、mLST8和mTOR構(gòu)成，通過磷酸化下游效應(yīng)分子來影響其表達(dá)，如4E-BPs和p70核糖體S6Ks。mTOR、S6K1和4E-BP1在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，尤其是在脊髓背角[13]。由于淺表背角是外周傳入神經(jīng)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一個(gè)突觸部位，在調(diào)節(jié)痛覺和嗎啡耐受方面起著重要作用[14]，故mTOR在SCI后的機(jī)械和熱痛覺過敏調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

MCP-1被證明能通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)疼痛，尤其對MCP-1(外周敏化)的外周機(jī)制研究較為透徹。如DRG神經(jīng)元釋放MCP-1可激活鄰近傷害感受神經(jīng)元的CCR2，通過激活瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)通道來提高這些神經(jīng)元的興奮性并抑制電壓依賴性鉀通道[15]。近年來MCP-1的中樞機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)。脊髓注射MCP-1可激活野生型脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞而不是CCR2基因敲除小鼠[16]。神經(jīng)損傷引起的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活可通過MCP-1抗體來緩解。此外，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中神經(jīng)損傷誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中p38激活在CCR2基因敲除小鼠中較輕[17]。由于小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是NP產(chǎn)生的關(guān)鍵，MCP-1可能通過這種機(jī)制增強(qiáng)NP。

研究發(fā)現(xiàn)，JNK是MAPK家族成員之一，可在神經(jīng)損傷后的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中持續(xù)活化，而JNK抑制劑SP600125可改善脊髓損傷后的NP癥狀[5-6]。雖然JNK通路和MCP-1通路均參與了NP的調(diào)控，但杏仁核中JNK/MCP-1信號通路是否參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控尚未見報(bào)道，本研究對其進(jìn)行了初步的探討。

本研究結(jié)果表明，SNL誘導(dǎo)后杏仁核的p-mTOR、p-JNK表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，且該增強(qiáng)效應(yīng)呈時(shí)間依賴性，表明在脊髓損傷引發(fā)NP的過程中，杏仁核中的mTOR和JNK途徑均被激活。進(jìn)一步分析顯示，d12的p-mTOR、p-JNK表達(dá)與MCP-1水平呈正相關(guān)，提示兩個(gè)途徑可能參與了杏仁核中MCP-1/CCR2途徑的激活。杏仁核注射p-mTOR、p-JNK抑制劑發(fā)現(xiàn)，MCP-1水平及陽性細(xì)胞數(shù)均降低，提示兩條通路的激活可能參與了杏仁核MCP-1的釋放增多。此外，采用化學(xué)手段抑制兩條通路活性可減輕脊髓損傷引起的NP癥狀，提示兩條通路在NP治療中有重要意義，可作為NP防治的靶點(diǎn)。

綜上所述，在NP中mTOR和JNK通路激活，抑制mTOR和JNK通路可達(dá)到緩解NP大鼠疼痛及杏仁核MCP-1升高的作用，對于NP的治療有一定意義。