葛 瑤，劉 琦，王春燕，劉淑鵬，程忠平

卵巢癌是婦科惡性腫瘤里致死率最高的腫瘤，大多數(shù)患者確診時已經(jīng)處于疾病晚期(III-IV期)[1]。目前中晚期卵巢癌患者的治療原則是以手術治療為主，輔以紫杉醇和鉑類藥物的化療，但對于晚期復發(fā)難治的卵巢癌患者療效有限，仍然需要尋求更有效的治療方法[2]。近年來，免疫細胞療法的出現(xiàn)為腫瘤治療帶來了新的方向，而嵌合抗原受體修飾自然殺傷(chimeric antigen receptor engineered-natural killer, CAR-NK)細胞是免疫細胞療法的新突破。這種特異性的基因改造使得NK細胞獲得了特異靶向殺傷腫瘤細胞的能力。理想情況下，CAR靶點一般為腫瘤細胞表面特異性高表達而正常細胞表面低表達的蛋白。間皮素作為一種膜表面糖蛋白，在卵巢癌中高表達，而在正常間皮組織中表達較低[3]。該研究構建了以間皮素為靶點的CAR-NK-92細胞，通過體內(nèi)外實驗分別驗證CAR-NK-92細胞對卵巢癌的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源和細胞系2例正常卵巢組織樣本和21例卵巢腫瘤組織樣本均來自同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。4～6 周齡雌性SPF級NCG 小鼠，16～18 g，共計12只，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號：SYXK(滬)2021-0012，合格證編號：NO.202144322。所有方案均經(jīng)同濟大學動物護理和使用委員會批準進行。人卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3及NK-92細胞購自中國科學院上海細胞庫，保存于同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科。OVCAR3-LUC細胞是由熒光素酶慢病毒pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE轉染OVCAR3細胞獲得。

1.2 主要試劑和儀器馬血清(horse serum, HS)(貨號：16050-122)和胎牛血清(foetal bovine serum, FBS)(貨號：10099-141)購自美國Gibco公司；重組人纖維蛋白(貨號：GMP-CH38)購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；PE anti-DYKDDDDK Tag 抗體購自美國Biolegend公司；抗間皮素(mesothelin, MSLN)抗體(貨號：A14099)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(貨號：C20301)購自美國英杰生命技術有限公司；干擾素γ (interferon-γ, IFN-γ)檢測試劑盒(貨號：DIF50C)和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor, TNF-α)檢測試劑盒(貨號：DTA00D) ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；D-熒光素鉀鹽(貨號：40902ES02)購自中國翌圣生物科技股份有限公司。FACSCanto II 流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)SKOV3、OVCAR3培養(yǎng)于含10% FBS的1640培養(yǎng)基，NK-92培養(yǎng)于添加0.2 mmol/L 肌醇、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、0.02 mmol/L葉酸、200 U/ml白細胞介素-2(interleukin-2, IL-2)、12.5%HS、12.5% FBS和1%青霉素鏈霉素溶液的MEMα培養(yǎng)基中。

1.4 方法

1.4.1CAR載體的構建 anti-MSLN的序列來自GenBank: AF035617.1，CAR的結構包含了胞內(nèi)CD137和CD3ζ信號轉導結構域，中間段CD8的跨膜區(qū)，胞外部分CD8鉸鏈區(qū)、Anti-MSLN scFv和Flag結構。與此同時，構建含有GFP熒光蛋白的空載體作為對照。

1.4.2MSLN-CAR-NK-92的構建 使用包裝MSLN-CAR載體的慢病毒轉染NK-92細胞。轉染前1 d，使用人纖維蛋白液包板24孔板，4 ℃冰箱過夜。轉染當天用生理鹽水將包板洗2次，再向板內(nèi)加入感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)70的慢病毒懸液、NK-92細胞及MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，放置培養(yǎng)箱5～6 h后補加含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；第2天1 000 r/min離心5 min，換液后繼續(xù)培養(yǎng)，第4天檢測轉染效率。

1.4.3流式細胞術檢測CAR-NK-92細胞的構建效率 將CAR-NK-92和NK-92細胞離心棄上清液，使用3%牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)重懸后，孵育20 min。使用PE anti-DYKDDDDK Tag流式抗體試劑進行細胞表面染色，孵育30 min，再用PBS洗2次，上機檢測。所有樣本在FACSCanto Ⅱ流式細胞儀上進行操作，使用FlowJo軟件進行分析。

1.4.4細胞毒性實驗 把CAR-NK-92、control-GFP(GFP空載慢病毒轉染的NK-92)與OVCAR3及SKOV3按照效應細胞 ∶靶細胞為2 ∶1和1 ∶1時共培養(yǎng)4 h，檢測上清液中LDH活性(反映細胞毒性)。陽性對照組為加入10 μl裂解液的卵巢癌細胞組，靶細胞對照組為不做處理的卵巢癌細胞組，使用酶標儀檢測490 nm處的吸光度判斷各組中LDH的活性。NK細胞的毒性計算公式為：裂解率(%)=(實驗組吸光度-靶細胞對照組吸光度)/(靶細胞最大裂解吸光度-靶細胞對照組吸光度)×100%。

1.4.5TNF-α及IFN-γ的檢測 將CAR-NK-92、control-GFP(GFP空載慢病毒轉染的NK-92)與OVCAR3及SKOV3按照效應細胞 ∶靶細胞為10 ∶1共培養(yǎng)4 h，使用ELISA法檢測上清液中TNF-α及IFN-γ的表達。

1.4.6免疫組化分析 將組織放入液體石蠟中，冷凍包埋切片。加山羊血清37 ℃溫箱中封閉40 min。再加入抗MSLN抗體(1 ∶1 000)孵育，4 ℃冰箱過夜。將石蠟切片放入PBS中洗滌后，孵育二抗(1 ∶10 000)，37 ℃溫箱中放置1 h。將石蠟切片放入PBS洗滌后，加SABC和顯色劑，蘇木精復染，使用正置顯微鏡觀察。使用ImageJ軟件對免疫組化結果進行分析。

1.4.7免疫熒光實驗 為了檢測卵巢癌細胞系OVCAR3和SKOV3上MSLN的表達，依次使用4% PFA和0.5% PBST對OVCAR3和SKOV3進行固定和通透，使用3%BSA封閉30 min，再使用anti-MSLN抗體孵育，放置4 ℃冰箱過夜，第2天使用紅色熒光Cy3二抗和DAPI試劑避光染色。使用激光共聚焦顯微鏡觀察OVCAR3和SKOV3上MSLN的表達。

1.4.8體內(nèi)實驗 小鼠飼養(yǎng)在無菌環(huán)境中，每天觀察小鼠飲食及健康狀況，每周記錄一次小鼠體質(zhì)量。在第0天時，將熒光素酶基因標記的OVCAR3細胞消化并用PBS重懸成每毫升懸液中含2×106個細胞，在NCG小鼠腹腔內(nèi)注射細胞懸液100 μl。在第4天和第11天，分別向小鼠腹腔注射1×107個CAR-NK-92細胞或者NK-92細胞。在此期間，使用活體成像儀觀察小鼠腹腔內(nèi)腫瘤生長情況?；铙w成像時，將小鼠放入麻醉箱中，使用異氟烷麻醉3 min，腹腔注射配置好的100 μl D-熒光素鉀鹽，底物注射10 min后進行活體成像檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理采用Prism 8.0軟件和Excel對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)均重復3次，結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗進行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原發(fā)性卵巢癌組織和卵巢癌細胞系MSLN的表達免疫組化結果顯示(圖1A)，MSLN在正常卵巢組織中呈低表達或者不表達，而在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達。為了更好地評估MSLN在卵巢癌組織中的表達情況，從每個樣本隨機選取一個視野，按照MSLN陽性和陰性區(qū)域所占百分比的高低繪制成柱狀圖(圖1B)，發(fā)現(xiàn)MSLN陽性率平均占(63±18.6)%，MSLN陰性率平均占(37±18.6)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.389，P<0.001)。這說明在原發(fā)性卵巢癌組織中，MSLN表達量較高。免疫熒光染色法檢測SKOV3和OVCAR3兩種卵巢癌細胞系上MSLN的表達情況，使用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)(圖1C)，MSLN在SKOV3和OVCAR3兩種細胞系表面呈現(xiàn)高表達。

2.2 CAR-NK-92的制備及體外作用研究CAR結構(圖2A)包含了Flag蛋白、anti-MSLN、CD8 hinge、跨膜域及細胞內(nèi)信號域CD137和CD3ζ序列，其中Flag蛋白作為標簽蛋白用來鑒定CAR的表達效率。使用CAR慢病毒和GFP空載慢病毒分別轉染NK-92細胞，構建CAR-NK-92 (CAR)和control-GFP。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)Flag陽性的CAR-NK-92細胞占比70%左右(圖2B)，說明采用的CAR NK轉染體系可以達到較高的轉染效率，獲得純度較高的CAR-NK-92細胞。

體外殺傷實驗結果顯示CAR-NK-92、control-GFP與卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3按照不同的效靶比共培養(yǎng)時，CAR-NK-92細胞對靶細胞的裂解率明顯強于control-GFP細胞，差異有統(tǒng)計學意義(效靶比2 ∶1：t=16.52，P<0.001)(效靶比1 ∶1：t=32.06，P<0.001)(圖2C)，說明CAR-NK-92細胞對卵巢癌細胞起到較強的殺傷作用。

圖2 CAR-NK-92的構建及體外作用分析A: MSLN-CAR結構示意圖；B: 流式細胞術檢測CAR-NK-92細胞所占的百分比；C: CAR-NK-92細胞在效應細胞與靶細胞比例為2 ∶1和1 ∶1時對卵巢癌細胞的細胞毒作用(n=3)；D: CAR-NK-92細胞與卵巢癌細胞共培養(yǎng)后上清液中IFN-γ、TNF-α的含量(n=3)；與Control-GFP組比較：*P<0.05，***P<0.001

細胞因子分泌結果顯示，CAR組分泌的IFN-γ平均值高于control-GFP組分泌的平均值，在靶細胞為SKOV3時，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.318,P<0.05)。同樣，CAR組分泌的TNF-α平均值也高于control-GFP組分泌的平均值，在靶細胞為OVCAR3時，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.6,P<0.05)(圖2D)，說明CAR NK細胞可以分泌更多的細胞因子來發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.3 CAR-NK-92的體內(nèi)抗腫瘤特性小鼠生物熒光成像結果顯示，與腫瘤組小鼠和NK-92組小鼠相比，CAR-NK-92組小鼠腫瘤生長較緩慢(圖3A)。同時對生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging, BLI)的數(shù)值統(tǒng)計顯示，與NK-92組相比，CAR-NK-92組小鼠腫瘤生長速度較緩慢，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.547,P<0.001)(圖3B)，說明CAR-NK-92具有較好的抗腫瘤作用。對小鼠的體質(zhì)量進行統(tǒng)計分析顯示，在腫瘤注射的第21天后，腫瘤組小鼠和NK-92組小鼠出現(xiàn)了體質(zhì)量增長緩慢的趨勢，而CAR-NK-92組小鼠依然保持較穩(wěn)定的體質(zhì)量增長速度(圖3C)，說明CAR-NK-92有較強的抗腫瘤作用，可以很好地維持小鼠的狀態(tài)。

圖3 小鼠體內(nèi)實驗驗證CAR-NK-92對卵巢癌的作用A: 小鼠活體成像圖；B: 小鼠BLI數(shù)值統(tǒng)計圖(n=4)；與腫瘤組比較：*P<0.05；與NK-92組比較：###P<0.001 ；C: 小鼠體質(zhì)量變化圖(n=4)

3 討論

卵巢癌是一種惡性侵襲性腫瘤，致死率較高，因此探索新的卵巢癌治療策略具有重要的臨床意義[4]。MSLN作為一種膜表面蛋白，在卵巢癌中特異性高表達，因此可以成為卵巢癌免疫治療的理想靶點[5]。在本研究中，卵巢癌組織中都檢測出了MSLN陽性，而在正常卵巢組織中幾乎沒有MSLN的表達，同時在兩種卵巢癌細胞系上也檢測出了MSLN陽性，與之前的研究[6]一致。本研究以間皮素為靶點，使用慢病毒轉染的方法構建了CAR-NK-92細胞，具有較強的抗腫瘤作用。其中，CAR結構中包含的CD137和CD3ζ作為NK細胞上的重要分子，對激活NK細胞起著重要的作用[7]；同時高效率的轉染提高了CAR-NK-92細胞的純度，也進一步提高了CAR-NK-92細胞的殺傷作用[8]。此外，在本研究中，CAR介導的殺傷作用伴隨著更高水平的IFN-γ和TNF-α的分泌，也進一步證實了CAR能夠介導更強大的殺傷作用。而在荷瘤小鼠實驗中，CAR組小鼠表現(xiàn)出了較緩慢的腫瘤生長速度，說明CAR-NK-92細胞在小鼠體內(nèi)能夠發(fā)揮較強的抗腫瘤作用。

NK細胞是一群先天毒性淋巴細胞，與T細胞相比具有較低的免疫原性。因此CAR NK被認為更有希望應用于腫瘤的臨床治療。當前CAR NK研究中較常使用的NK細胞有外周血源NK細胞、臍帶血源NK細胞和NK細胞系。本研究選用NK-92細胞系作為研究對象，因為NK-92細胞在體外IL-2刺激下，能夠大量擴增，并且在表型特征上不會發(fā)生較大的改變[9]；與此同時，NK-92細胞容易受慢病毒轉染，可以得到高純度的CAR-NK-92細胞[8]。因此，CAR-NK-92細胞在腫瘤治療領域具有良好的應用前景。當前已經(jīng)有很多國家正在積極開展CAR-NK-92研究，并且已經(jīng)取得不錯的治療效果[10]。但是NK-92細胞來源特殊，在體內(nèi)不能持續(xù)增殖，因而發(fā)揮的抗腫瘤作用有限[11]。為了解決CAR NK細胞在體內(nèi)不能持續(xù)增殖的問題，Teng et al[12]研究發(fā)現(xiàn)在CAR序列中添加編碼IL15序列可以顯著提高PSCA-CAR-NK細胞在小鼠體內(nèi)的存活時間，這項研究為CAR NK細胞在臨床上的應用提供了新的研究思路。

在本研究中，MSLN-CAR-NK-92細胞表現(xiàn)出了較強的抗卵巢癌作用，可以為卵巢癌患者提供較好的治療策略。但本實驗仍然存在不足之處，包括對小鼠生存期周期的觀察時間不足及缺少CAR-NK-92細胞在小鼠體內(nèi)存活時間的研究。因此在后續(xù)的研究中，將進一步改進實驗方案，真正建立卵巢癌患者臨床可用的、安全有效的CAR NK細胞。