邱軍輝，劉美志，孫杜桑，潘 婷，趙維維，沙雯君，魯 郡，雷 濤，

糖尿病是全球增長最快的疾病之一，預(yù)計到2045年將影響6.93億成年人[1]。近年來，我國糖尿病的發(fā)病率逐年升高，其主要危害在于糖尿病的慢性并發(fā)癥，而糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥是血管病變[2]。研究[3]顯示血管內(nèi)皮功能損傷既是血管病變的重要病理基礎(chǔ)，也是糖尿病預(yù)后的決定性因素。糖尿病患者體內(nèi)多同時存在高血糖和脂代謝紊亂狀態(tài)，低密度脂蛋白極易發(fā)生非酶促糖基化，形成糖化低密度脂蛋白(glycated low density lipoprotein，Gly-LDL)[4]。Gly-LDL能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能，但具體作用機(jī)制尚未闡明。該研究旨在探討Gly-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制，為防治血管內(nèi)皮損傷提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 HUVECs購自上海中科院細(xì)胞研究所。

1.1.2主要試劑 LDL Human購自廣州奕元生物科技有限公司；葡萄糖購自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所； ECM購自美國ScienCell公司；0.25%胰酶消化液購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購自上海碧云天生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司； PrimeScriptTMRT Master Mix Kit和SYBR?Primix Ex TagTMKit購自美國TaKaRa公司；Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6) 、β-actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.1.3主要儀器 細(xì)胞超凈工作臺購自ESCO公司；全波長酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司；熒光顯微鏡購自美國萊卡公司；電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；離心機(jī)購自Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1Gly-LDL的制備 參考文獻(xiàn)[5]報道，在無菌條件下，將0.2 mol/L葡萄糖與2 g/L LDL Human在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4周，同時加入1 g/L EDTA和10 μmol/L二丁基羥基甲苯。第1、7、14、21、28天提取100 μl樣品保存于-80 ℃，檢測Gly-LDL水平。孵育完成后在pH 7.4 的PBS緩沖液中透析48 h備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存細(xì)胞，在37 ℃水浴鍋中解凍并離心，用完全培養(yǎng)基復(fù)蘇細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力 將處于對數(shù)生長期的HUVECs制備細(xì)胞懸液，按照1×104個細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞懸液接種至96孔板中，每孔100 μl，每組設(shè)立5個重復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，按照不同干預(yù)措施將細(xì)胞分為對照組、陽性對照組[50 mg/L普通低密度脂蛋白 (normal low density lipoprotein, n-LDL]、Gly-LDL (50、75、100 mg/L) 組，干預(yù)24 h后用含10% CCK-8的培養(yǎng)基進(jìn)行換液，避光孵育，每隔30 min使用酶標(biāo)儀測定每組在450 nm處的吸光度，取各組實驗的平均值，重復(fù)3次實驗。

1.2.4劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 在6孔板中以2×105個細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%～90%時，用槍頭于板底劃線，PBS洗去漂浮細(xì)胞，更換含1%FBS低血清培養(yǎng)基后加入不同濃度Gly-LDL繼續(xù)培養(yǎng)，于顯微鏡下拍攝0 h細(xì)胞劃痕圖片，12 h后在同一位置拍攝圖片，計算劃痕區(qū)域面積，求得愈合率。

1.2.5ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)含量 取24 h后各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1含量。

1.2.6qRT-PCR檢測HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA水平 在6孔板中培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，干預(yù)24 h后收集各組內(nèi)皮細(xì)胞，按說明書提取內(nèi)皮細(xì)胞中總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×TB Green 10.0 μl，引物各0.4 μl，引物序列見表1，50×ROX ReferenceDye Ⅱ 0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl，總體系20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸34 s，共40個循環(huán)，95 ℃延伸15 s。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算。

表1 引物序列

1.2.7Western blot檢測TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白水平 將3～4代HUVECs細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%時，將完全培養(yǎng)基更換成低血清培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理8 h，對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理24 h后，吸棄6孔板中培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌2次，每孔加入120 μl RIPA裂解液置于冰上充分裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液至預(yù)冷離心管中，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書步驟對各組樣品進(jìn)行定量檢測，加入適量蛋白上樣緩沖液后100 ℃加熱5 min變性。取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%BSA室溫封閉1 h，洗膜后分別加入TLR4一抗(1 ∶1 000)、HIF-1α一抗(1 ∶1 000)、TNF-α一抗(1 ∶1 000)、IL-6一抗(1 ∶1 000)、β-actin一抗(1 ∶5 000) 4 ℃孵育過夜，次日TBST漂洗PVDF膜3次，5 min/次，加入二抗(1 ∶20 000)室溫?fù)u床孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次。暗室ECL顯影獲取圖片，用ImageJ軟件分析出各組蛋白與內(nèi)參的灰度值，得出各組蛋白與內(nèi)參的灰度比值，反映出各組蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.8Gly-LDL干預(yù)下沉默TLR4、HIF-1α后TLR4、HIF-1α蛋白表達(dá)水平 在6孔板中接種3～5代細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)約為2×105個，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞生長至80%左右開始后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基換成不含血清和雙抗的培養(yǎng)基，以免影響轉(zhuǎn)染效率。分別設(shè)為對照組、模型組(Gly-LDL 100 mg/L)、si-TLR4組(Gly-LDL 100 mg/L+si-TLR4)、TLR4空載組(Gly-LDL 100 mg/L+si-NC1)、si-HIF-1α組(Gly-LDL 100 mg/L+si-HIF-1α)和HIF-1α空載組(Gly-LDL 100 mg/L+si-NC2)。提前將si-TLR4、si-NCl、si-HIF-1α、si-NC2凍干粉用原裝DEPC水進(jìn)行溶解，取siRNA，用opti-MEM培養(yǎng)基稀釋siRNA，終濃度為10 μmol/L，總體積為250 μl，靜置5 min；同時取2 μl Lipofectamine 2000與248 μl opti-MEM培養(yǎng)基混勻，靜置5 min。將上述兩種液體混合，靜置20 min。每孔先加入1 500 μl opti-MEM培養(yǎng)基，20 min之后將500 μl混合液加入6孔板中。6 h后將opti-MEM更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，后續(xù)根據(jù)實驗需要進(jìn)行下一步操作。實驗重復(fù)3次。小干擾序列見表2。

表2 小干擾序列

2 結(jié)果

2.1 Gly-LDL對HUVECs增殖活力的影響不同濃度Gly-LDL處理內(nèi)皮細(xì)胞，在24 h檢測細(xì)胞增殖活力的改變，CCK-8法檢測結(jié)果顯示：細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.96,P<0.001)，與對照組OD值(1.09±0.10)相比，n-LDL組OD值(0.96±0.03)顯示對HUVECs增殖活力無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組OD值分別為(0.70±0.03)、 (0.59±0.02)、 (0.53±0.03)，與對照組相比，細(xì)胞存活率分別下降36.16%、45.77%、51.24%，呈劑量依賴性(P<0.01)；與n-LDL組相比，Gly-LDL 50 mg/L組細(xì)胞存活率下降27.08%(P<0.001)。

2.2 Gly-LDL對HUVECs遷移能力的影響不同濃度Gly-LDL處理HUVECs，在12 h檢測細(xì)胞遷移能力的改變，細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果(圖1)顯示：細(xì)胞遷移能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=139.85,P<0.001)，與對照組愈合率(52.03±1.79)相比，n-LDL組愈合率(48.55±1.93)顯示對細(xì)胞遷移能力無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組愈合率分別為(35.88±2.40)、(22.68±3.10)、(17.65±1.59)，與對照組相比，細(xì)胞遷移率分別下降31.04%、56.40%、66.08%，呈劑量依賴性(P<0.001)；與n-LDL組相比，Gly-LDL 50 mg/L組細(xì)胞遷移率下降26.10%(P<0.01)。

圖1 細(xì)胞劃痕實驗檢測不同濃度Gly-LDL對HUVECs遷移能力的影響 ×100

2.3 Gly-LDL對HUVECs細(xì)胞因子表達(dá)的影響ELISA法檢測TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1分泌水平，結(jié)果(表3)顯示：各組TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1分泌量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=333.80、68.91、127.07、79.56，P<0.001)，與對照組相比， n-LDL組TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與n-LDL組相比，Gly-LDL 50 mg/L組中TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平增高，其中TNF-α、IL-6、ICAM-1分泌水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 Gly-LDL對HUVECs細(xì)胞因子表達(dá)的影響

2.4 Gly-LDL對HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的影響不同濃度Gly-LDL處理細(xì)胞24 h后，qRT-PCR結(jié)果(圖2)顯示：各組TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=174.35、275.06、126.54、109.70，P<0.05),與對照組相比，n-LDL組和Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組誘導(dǎo)的HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與n-LDL組相比，Gly-LDL(75、100 mg/L)組中TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并呈劑量依賴性(P<0.05)。

圖2 Gly-LDL對HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的影響A：對照組；B：n-LDL組；C：Gly-LDL 50 mg/L組；D：Gly-LDL 75 mg/L組；E：Gly-LDL 100 mg/L組；與對照組比較：*P<0.05；與n-LDL組比較：#P<0.05

2.5 Gly-LDL對HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)的影響不同濃度Gly-LDL處理細(xì)胞24 h后，Western blot檢測炎癥蛋白TLR4，HIF-1α、IL-6、TNF-α水平，結(jié)果(圖3)顯示：各組TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.63、42.80、78.25、21.13，P<0.001)，與對照組相比，n-LDL組中TLR4、TNF-α蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，Gly-LDL 50 mg/L 組中HIF-1α、TNF-α蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Gly-LDL 75、100 mg/L組中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 Gly-LDL對TLR4/HIF-1α信號通路相關(guān)蛋白的影響A：對照組；B：n-LDL組；C：Gly-LDL 50 mg/L組；D：Gly-LDL 75 mg/L組；E：Gly-LDL 100 mg/L組；與對照組比較：*P<0.05；與n-LDL組比較：#P<0.05

2.6 檢測HUVECs中沉默TLR4、HIF-1α蛋白效率分別用si-TLR4、si-HIF-1α轉(zhuǎn)染HUVECs，Western blot結(jié)果(圖4)顯示：與si-NC組相比，si-TLR4組中TLR4蛋白表達(dá)下調(diào)44.18%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與si-NC組相比，si-HIF-1α組中HIF-1α蛋白表達(dá)下調(diào)69.10%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖4 si-TLR4和si-HIF-1α對HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白沉默的影響A：沉默TLR4效率檢驗；B：TLR4蛋白統(tǒng)計分析圖；C：沉默HIF-1α效率檢驗；D：HIF-1α蛋白統(tǒng)計分析圖；與si-NC組比較：***P<0.001

2.7 Gly-LDL干預(yù)下沉默TLR4、HIF-1α后對HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白表達(dá)的影響分別用si-TLR4、si-HIF-1α轉(zhuǎn)染HUVECs后，按照實驗分組加入100 mg/L Gly-LDL干預(yù)24 h，結(jié)果(圖5)顯示：與對照組相比，模型組中TLR4、HIF-1α蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組相比，si-TLR4組中TLR4、HIF-1α蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與模型組相比，si-HIF-1α組中HIF-1α蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，TLR4蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，si-HIF-1α組中TLR4蛋白升高(P<0.05)。

圖5 沉默TLR4、HIF-1α對HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白表達(dá)的影響A：對照組；B：模型組；C：si-TLR4組；D：TLR4空載組；E：si-HIF-1α組；F：HIF-1α空載組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

糖尿病是一種以糖代謝紊亂為主的臨床綜合征，糖尿病大血管并發(fā)癥是糖尿病患者致殘致死主要原因[6]，血管內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致糖尿病大血管并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[7-8]。因此，血管內(nèi)皮損傷是防治糖尿病大血管病變的重要關(guān)注點。目前認(rèn)為，血管內(nèi)皮損傷的出現(xiàn)，在于糖尿病高血糖時，體內(nèi)各種蛋白非酶促糖基化反應(yīng)增強(qiáng)。而晚期糖基化蛋白終末產(chǎn)物(advanced glycated end products，AGEs)可損害內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及其功能，從而誘發(fā)糖尿病血管病變[9-10]。Gly-LDL是AGEs中最主要成分之一，但目前Gly-LDL與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的關(guān)系僅停留在相關(guān)性研究中。本研究用Gly-LDL(50、75、100 mg/L)處理HUVECs 24 h，存活率降低36.16%、45.77%和51.24%；遷移率降低31.04%、56.40%和66.08%；并促進(jìn)TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1細(xì)胞因子分泌，表明Gly-LDL能夠降低細(xì)胞生存率和遷移能力，促進(jìn)炎癥因子釋放，并呈濃度依賴性。

大量研究[11-12]顯示糖尿病血管內(nèi)皮損傷與TLR4信號激活有關(guān)。在血管內(nèi)皮病變患者外周血中，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為TLR4信號過度激活，使機(jī)體處于高度促炎狀態(tài)[13]。TLR4參與糖尿病病理生理過程，TLR4能夠調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活性，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧增加，加速糖尿病大血管并發(fā)癥發(fā)展[14]；在糖尿病血管內(nèi)皮損傷中，樹突狀細(xì)胞通過RAGE-TLR4-PKCβ1信號通路介導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)[15]；高遷移率組蛋白(high mobility group protein B1,HMGB1)在糖尿病發(fā)生過程中通過TLR4/eNOS通路參與內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷[16]。為了驗證Gly-LDL是否通過TLR4信號通路介導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，本研究選用HUVECs作為研究對象，結(jié)果顯示Gly-LDL能提高HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白水平，表明Gly-LDL能夠激活TLR4信號通路，促進(jìn)炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。但是Gly-LDL通過TLR4信號如何調(diào)控炎癥反應(yīng)，是目前尚未解決的科學(xué)問題。研究[17]表明TLR4信號能夠調(diào)控HIF-1α影響TNF-α、IL-1β分泌，HIF-1α是人和哺乳動物中關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，常氧狀態(tài)下HIF-1α的脯氨酰胺基和門冬酰胺基發(fā)生羥基化，與E3泛素化連接酶結(jié)合，VHL蛋白能募集泛素連接酶，與泛素化連接酶結(jié)合的HIF-1α被蛋白酶體降解；低氧狀態(tài)下，HIF-1α羥基化被抑制，與HIF-1β結(jié)合，在細(xì)胞核內(nèi)與缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄[18]。HIF-1α能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1表達(dá)，并且涉及炎癥反應(yīng)[19]。為了驗證TLR4能否調(diào)控HIF-1α表達(dá)，在Gly-LDL干預(yù)下沉默TLR4、HIF-1α基因，結(jié)果顯示：Gly-LDL能夠上調(diào)TLR4和HIF-1α蛋白水平，表明兩者可能存在協(xié)同作用；沉默TLR4基因后，TLR4和HIF-1α蛋白表達(dá)下調(diào)，而沉默HIF-1α基因后，只有HIF-1α蛋白表達(dá)下調(diào)，而TLR4蛋白在Gly-LDL干預(yù)下仍是上調(diào)，因此推測，Gly-LDL上調(diào)TLR4信號，激活HIF-1α表達(dá)介導(dǎo)HUVECs炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示：Gly-LDL能夠上調(diào)TLR4信號，激活HIF-1α的表達(dá)介導(dǎo)炎癥因子釋放，降低HUVECs生存率和遷移能力，誘導(dǎo)HUVECs損傷。Gly-LDL水平有望成為衡量糖尿病血管內(nèi)皮損傷指標(biāo)之一，并為糖尿病血管內(nèi)皮損傷臨床治療提供新的潛在靶點。