朱 君，朱正春，秦學金，張 迪，郗玉巧，李 佳，仲 飛,4

腦膠質瘤是源自神經上皮的惡性腫瘤，其惡性程度、致死率、復發(fā)率以及對化療的耐藥性均較高[1]。2014年至2018年期間，CBTRUS統(tǒng)計報告有83 029人死于中樞神經系統(tǒng)腫瘤，其中最常見是膠質母細胞瘤[2]。替莫唑胺(temozolomide, TMZ)為基礎的系統(tǒng)化療對腦膠質瘤有確切療效[3]。但是對于TMZ耐藥的腦膠質瘤，很難預防其進展或復發(fā)[4]。因此，闡明TMZ耐藥的發(fā)生機制在臨床上對改善膠質瘤的化療效果有極其重要的意義。LncRNA被歸類為具有調控作用的非編碼RNA[5]。有研究[6]證明LncRNA在癌癥的起始、進展和化療耐藥過程中起到重要作用。LncRNA MEG3是LncRNAs中的一種，參與多種腫瘤耐藥性的調控[7]，但是其是否參與調控膠質瘤的耐藥性鮮有報道，現(xiàn)以U87/TMZ細胞為研究對象，觀察LncRNA MEG3對其耐藥性的影響，以期為臨床逆轉膠質瘤耐藥研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人腦膠質瘤細胞株U87購自上?？茖W院細胞庫。

1.1.2主要試劑 替莫唑胺(貨號：T2577-25MG)購自美國Sigma公司；U-87 MG細胞專用培養(yǎng)基(貨號：CM-0238)購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胰酶消化液(貨號：SH30042.01B)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(貨號：11011-8611)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；RNA提取試劑盒(貨號：15596018)、qRT-PCR試劑盒(貨號：CS11733046)、脂質體Lipofectamine 2000(貨號：11668)購自美國 Invitrogen公司；RIPA裂解液(貨號：P0013C)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號：P0012)、ECL液(貨號：P0018AS)、MTT檢測試劑盒(貨號：C0009S)及細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：C1062M)購自碧云天生物技術有限公司；Matrigel基質膠(貨號：356234)購自美國 BD公司；Transwell小室(貨號：3421)購自Corning公司；抗體購自Abcam公司，一抗：MDM2抗體(貨號：ab259265)、 p53抗體(貨號：ab32389)、GADPH抗體(貨號：ab263962)；二抗：辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG(貨號：ab97126)、羊抗兔 IgG(貨號：ab97051)，所有引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.1.3主要儀器 QP-80二氧化碳培養(yǎng)箱(中國濟南鑫貝西生物技術有限公司)；TS100型倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；CFX ConnectTM實時熒光定量 PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；全自動酶標儀(美國Molecular Devices 公司)；流式細胞儀(美國Beckman Coulter FC500公司)。

1.2 方法

1.2.1膠質瘤細胞株U87的培養(yǎng) 用U-87 MG細胞專用培養(yǎng)基(MEM+10% FBS+1% P/S Solution)培養(yǎng)細胞，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2獲得性TMZ耐藥膠質瘤細胞的構建 將U87細胞(1×105/ml)暴露于初始濃度為5 μg/ml的TMZ中15～20 d。觀察細胞生長情況，U87細胞生長至對數期后，倍增TMZ濃度繼續(xù)誘導，直至TMZ濃度達160 μg/ml，每個梯度濃度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)培養(yǎng)15～20 d。最終獲得耐藥細胞U87/TMZ。

1.2.3細胞轉染 將U87/TMZ細胞以5×105個/孔接種至6孔板，融合度達70%～80%時，用脂質體 Lipofectamine 2000轉染pcDNA-MEG3至U87/TMZ中作為LncRNA MEG3過表達組，轉染pcDNA至U87/TMZ中作為LncRNA MEG3空載體組，以常規(guī)培養(yǎng)的U87/TMZ作為空白組。設置組別如下：pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組。轉染48 h后觀察，然后用10 μg/ml TMZ繼續(xù)處理細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4qRT-PCR檢測細胞中LncRNA MEG3的表達 取對數生長期的U87和U87/TMZ細胞，根據試劑盒操作步驟，采用TRIzol法提取細胞總RNA，然后逆轉錄成cDNA。后續(xù)cDNA被用作檢測基因表達的模板進行PCR擴增反應。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt計算LncRNA MEG3的表達。LncRNA MEG3引物序列F：5′- GGGCATTAAGCCCTGACCTT-3′，R：5′-CCTTGGGGAGGGAAACACTC-3′；內參GADPH引物序列F：5′-ATGTTGCAACCGGGAAGGAA -3′，R：5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG -3′。

1.2.5Western blot 檢測U87/TMZ細胞中LncRNA MEG3相關蛋白表達變化 pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細胞轉染成功后，再用10 μg/ml TMZ處理48 h，用RIPA裂解細胞，從三組細胞中提取蛋白質，并用BCA法進行蛋白定量。進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉移到PVDF膜上，并用封閉液室溫封閉2～3 h，一抗孵育12 h，一抗?jié)舛葹椋篗DM2 (1 ∶400)、p53(1 ∶400)、GAPDH(1 ∶1 000)，二抗孵育2 h，二抗?jié)舛葹椋嚎寡?1 ∶5 000)、抗兔(1 ∶3 000)。ECL發(fā)光檢測，以GAPDH作為內參，分析結果。

1.2.6MTT法檢測細胞增殖 將所需細胞培養(yǎng)至對數期，以9×103個/孔傳代至96孔板中。次日，加入含梯度濃度(5、10、20、40、80 μg/ml)TMZ處理48 h。處理結束后加入MTT溶液20 μl，4 h后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，用酶標儀檢測490 nm下的吸光度。

1.2.7細胞克隆實驗檢測細胞增殖情況 收集pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細胞，調整細胞密度，接種至6孔板中，在含10 μg/ml TMZ的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2～3周后用4%多聚甲醇固定細胞，GIMSA染色10～30 min，洗去染液后拍照進行圖像分析。

1.2.8Transwell實驗檢測細胞侵襲 將基質膠與無血清培養(yǎng)基以1 ∶3的比例配置，每個Transwell小室中加入50 μl，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中凝固。收集pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細胞，用含有10 μg/ml TMZ無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,調整細胞濃度為1×105/ml，在上室加入100 μl細胞懸液，24孔板底部中加入600 μl含10%血清培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)48 h，再用甲醇固定30 min，適當風干后，結晶染液染色15 min，在顯微鏡下計數。

1.2.9流式細胞技術檢測細胞凋亡 收集pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細胞，調整細胞密度，用10 μg/ml TMZ處理細胞，然后分裝到5 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min。按照試劑盒說明書用PBS洗滌2次后加入binding buffer(500 μl)，加入 Annxine-FITC(5 μl)和 Propidiumlodide(5 μl)混勻，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.10動物實驗 4周齡BALB/c雌性裸鼠12只，購自上海靈暢生物科技有限公司，飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度(23±2) ℃，濕度50%～56%。該實驗相關內容經安徽醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。收集2×106個U87/TMZ細胞(pcDNA-MEG3組和pcDNA組細胞)，接種于裸鼠右側腋窩。在注射U87/TMZ細胞25 d后，每天向小鼠體內注射5 mg/kg TMZ。實驗結束后，吸入麻醉處死小鼠，記錄腫瘤體積和重量。

2 結果

2.1 U87細胞和U87/TMZ細胞的增殖能力MTT實驗結果顯示，U87細胞與U87/TMZ細胞用5、10、20、40、80 μg/ml TMZ處理48 h后，細胞抑制率逐漸升高。與U87細胞相比，U87/TMZ細胞的抑制率下降(P<0.01)，見圖1。

圖1 不同濃度TMZ對U87和U87/TMZ細胞生長抑制率的影響與U87細胞比較：**P<0.01

2.2 LncRNA MEG3在U87細胞和U87/TMZ細胞中的表達qRT-PCR結果顯示，在mRNA水平上，U87/TMZ細胞中LncRNA MEG3的表達量低于U87細胞(t=61.85,P<0.01)，見圖2。

圖2 U87和U87/TMZ細胞 LncRNA MEG3表達情況與U87細胞比較：**P<0.01

2.3 U87/TMZ細胞中LncRNA MEG3基因表達變化qRT-PCR檢測結果顯示，與pcDNA組和Control組比較，pcDNA-MEG3組LncRNA MEG3 mRNA的表達水平較高(F=602.4,P<0.01)，見圖3。

圖3 轉染后各組U87/TMZ細胞LncRNAMEG3的表達情況與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.4 U87/TMZ細胞LncRNA MEG3相關蛋白表達變化Western blot結果顯示，與Control組和pcDNA組相比，pcDNA-MEG3組的MDM2蛋白表達降低(F=28.1,P<0.01)，p53蛋白表達升高(F=22.14,P<0.01)，見圖4。

圖4 轉染后各組U87/TMZ細胞MDM2、p53蛋白的表達情況與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.5 LncRNA MEG3過表達聯(lián)合TMZ(10 μg/ml)對U87/TMZ細胞增殖的影響細胞克隆實驗結果顯示，與Control組和 pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組的細胞增殖速度降低(F=389,P<0.01)，見圖5。

2.6 LncRNA MEG3過表達聯(lián)合TMZ(10 μg/ml)對U87/TMZ細胞侵襲的影響Transwell實驗結果顯示，與Control組和 pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組的細胞侵襲能力降低(F=594.4,P<0.01)，見圖6。

圖6 轉染后各組U87/TMZ細胞侵襲能力的影響情況 ×40與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.7 LncRNA MEG3過表達聯(lián)合TMZ(10 μg/ml)對U87/TMZ細胞凋亡率的影響流式細胞術檢測結果顯示，與Control組和 pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組的細胞凋亡率升高(F=477.6,P<0.01)，見圖7。

圖7 轉染后各組U87/TMZ細胞凋亡的影響情況與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.8 LncRNA MEG3過表達聯(lián)合TMZ對小鼠移植瘤生長的影響與pcDNA組相比，pcDNA-MEG3組的腫瘤生長減弱。腫瘤切除后，pcDNA-MEG3組腫瘤體積小于pcDNA組(P<0.01)，pcDNA-MEG3組腫瘤質量小于pcDNA組(t=12.02,P<0.01)，見圖8。綜上所述， LncRNA MEG3的過表達在體外和體內都逆轉了TMZ耐藥膠質瘤細胞的化療耐藥性。

圖8 小鼠體內成瘤情況A：右側腋下原位移植瘤圖；B：裸鼠腫瘤形態(tài)和大??；C：移植瘤的體積生長曲線；D：兩組移植瘤的質量；與pcDNA組比較：**P<0.01

3 討論

化療是癌癥治療中的主要治療手段之一，90%的化療失敗都與腫瘤耐藥相關[8]。腫瘤細胞可由于內在因素(如突變、易位、表觀遺傳因素)和外在因素(如缺氧、pH、激素、抗腫瘤藥物)而產生耐藥性[9]。筆者推測LncRNA MEG3可能參與TMZ在膠質瘤中的耐藥性調控。本研究通過MTT法檢測膠質瘤細胞和TMZ耐藥膠質瘤細胞的細胞活力，采用qRT-PCR法檢測LncRNA MEG3在膠質瘤細胞和TMZ耐藥膠質瘤細胞表達量，發(fā)現(xiàn)TMZ耐藥膠質瘤細胞的細胞活力和 LncRNA MEG3表達水平更低。構建LncRNA MEG3過表達的TMZ耐藥膠質瘤細胞，并設置空載體和對照組；Western blot法分析各組細胞LncRNA MEG3相關蛋白表達；細胞克隆實驗、Transwell實驗、流式細胞術檢測各組細胞增殖、侵襲、凋亡能力，發(fā)現(xiàn)LncRNA MEG3過表達組的 LncRNA MEG3 mRNA及p53蛋白表達水平均有上調，MDM2蛋白表達下調，過表達的LncRNA MEG3能抑制細胞的增殖、侵襲和凋亡能力。小鼠實驗進一步表明，LncRNA MEG3的過表達逆轉了TMZ耐藥的膠質瘤細胞的化療耐藥性。

已有文獻[10-14]報道LncRNA MEG3 在腫瘤抑制中發(fā)揮重要作用，并參與了多種腫瘤的耐藥性調控，包括結直腸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等。本研究表明LncRNA MEG3在TMZ耐藥膠質瘤細胞中表達降低，其過表達可逆轉對TMZ的耐藥性。因此，LncRNA MEG3可能成為TMZ耐藥膠質瘤化療的一個預后分子標志物和潛在靶點。有文獻[15]報道膠質瘤化療耐藥可能與細胞鐵死亡、凋亡、焦亡等死亡機制相關。然而，LncRNA MEG3在膠質瘤耐藥中的確切生物學行為及其具體分子機制還需進一步研究，為今后膠質瘤的臨床基因治療和新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的思路和理論依據。