趙 晴，劉 艷，鄧淵潤

宮頸癌為臨床最常見的女性上皮性惡性腫瘤，多形成于宮頸上皮組織瘤變[1-2]。宮頸癌具有發(fā)病率高、治療難度大、病死率高等特點(diǎn)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，宮頸癌發(fā)病率、病死率均為婦科惡性腫瘤首位，多發(fā)于中年患者[3-4]。放化療、外科手術(shù)等均為宮頸癌的常用治療手段，但因個(gè)體差異，治療效果差異較大。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)-殺傷細(xì)胞(killer cell, CIK)生物細(xì)胞免疫療法在惡性腫瘤臨床治療中應(yīng)用較為廣泛，可促進(jìn)免疫細(xì)胞的恢復(fù)[5]。張春利 等[6]研究表明，DC-CIK生物細(xì)胞可對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有較高的殺傷效應(yīng)，但為對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行分析。該研究建立DC-CIK共培養(yǎng)體系對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，旨在探究DC-CIK細(xì)胞誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞休眠的作用及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑宮頸癌SiHa細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。小鼠抗兔磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抗體(美國Hyclone公司)；大鼠抗小鼠蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)抗體(中國Selleck公司)；大鼠抗兔哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白(mammalian target protein of sirolimus, mTOR)抗體(美國Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠上皮性鈣黏附素(epithelial calcium adhesins, E-cadherin)抗體(美國BD公司)；大鼠抗小鼠MMP-9抗體(德國Sigma公司)；PCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司；貨號(hào)KG204]，matrigel基底膜膠(上海善然生物科技有限公司；貨號(hào)356234)，四唑鹽(MTT)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司提供；貨號(hào)GL0510-OYT)；Transwell板(上海偉進(jìn)生物科技有限公司；貨號(hào)3422)。

1.2 宮頸癌SiHa細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)凍存宮頸癌SiHa細(xì)胞進(jìn)行火浴處理，之后置于含10%胎牛血清培養(yǎng)基，3 000 r/min離心后重懸、傳代，將培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞培養(yǎng)選取2020年3月-2021年3月于南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院就診的、未進(jìn)行過相關(guān)治療的宮頸癌患者10例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例，共抽取患者清晨空腹靜脈血60 ml，添加200 μl肝素鈉。取患者淋巴細(xì)胞分離液50 ml，以每管5 ml分于10支離心管，均添加靜脈血6 ml，之后2 500 r/min離心15 min。取2個(gè)消毒后的50 ml離心管，取離心后上層血清置于一管內(nèi)，取離心后中層細(xì)胞置于另一管中，并添加生理鹽水將管中液體補(bǔ)至50 ml，細(xì)胞計(jì)數(shù)后5 000 r/min離心10 min。提取5×107個(gè)細(xì)胞用于DC細(xì)胞培養(yǎng)，其余細(xì)胞用于CIK細(xì)胞培養(yǎng)，此時(shí)記為第1天。添加20%自體血清、腺嘌呤核苷三磷酸及1 000 μg/ml IFN-γ，次日添加100 μg/ml IL-1α、300 μg/ml IL-2、50 ng/ml CD3單克隆抗體，觀察細(xì)胞數(shù)量，相應(yīng)補(bǔ)加培養(yǎng)基擴(kuò)增，第8天與DC細(xì)胞共培養(yǎng)。DC細(xì)胞接種至6孔板(密度5×107個(gè)/ml)，2 ml/孔，此時(shí)記為第1天，添加500 μg/ml IL-4、1 000 μg/ml GM-CSF，第4天補(bǔ)加2 ml DC培養(yǎng)液，第6天添加抗原，第7天添加500 μg/ml TNF-α。第8天使用巴氏管收集DC細(xì)胞(鋪板密度1×107個(gè)/ml)及CIK細(xì)胞(1×109個(gè)/ml)混合共培養(yǎng)，根據(jù)混合后細(xì)胞數(shù)量補(bǔ)加培養(yǎng)基擴(kuò)增，第10天對(duì)培養(yǎng)的DC-CIK進(jìn)行微生物檢測(cè)，第14天用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組取生長狀態(tài)較好的對(duì)數(shù)生長期SiHa細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，并接種于96孔板，濃度為每孔5×104個(gè)，將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內(nèi)過夜培養(yǎng)。分別將100 μl培養(yǎng)基、培養(yǎng)5 d的DC細(xì)胞、培養(yǎng)7 d的CIK細(xì)胞及聯(lián)合培養(yǎng)3 d的CIK-DC細(xì)胞每孔均為1×105個(gè)接種于96孔板(鋪有靶細(xì)胞)，分別為宮頸癌組、DC組、CIK組、DC-CIK組。各組細(xì)胞均于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，CCK-8試劑加至孔內(nèi)(20 μl/孔)，再次培養(yǎng)2 h，觀察各組細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞生物學(xué)行為檢測(cè)

1.5.1MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化 使用0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液并接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，2×103個(gè)/孔，將96孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng)24、48、72 h加入20 μl MTT，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.5.2TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 4組細(xì)胞均添加蛋白酶K 20 μg/ml進(jìn)行培養(yǎng)，1.5 h后去除蛋白并添加平衡緩沖液100 μl及TdT酶反應(yīng)液，置于遮光環(huán)境中培養(yǎng)1 h后添加100 μl SSC溶液，靜置30 min后取出清洗，DAPI復(fù)染后遮光培養(yǎng)10 min，清洗、封片觀察。

1.5.3Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 小室濕化后添加細(xì)胞懸液200 μl，下室內(nèi)添加細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，使用細(xì)胞培養(yǎng)箱室內(nèi)培養(yǎng)1 d，第2天取出后使用PBS液清洗，之后使用4%多聚甲醛進(jìn)行染色，靜置30 min后使用顯微鏡觀察。

1.5.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 使用胰蛋白酶消化處理細(xì)胞，細(xì)胞懸液接種于6孔板，使用10 μl移液器槍頭垂直于孔板底部畫直線，使用PBS緩沖液清洗后室內(nèi)培養(yǎng)1 d，拍照計(jì)算劃痕。

1.6 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、侵襲蛋白表達(dá)4組細(xì)胞分別取50 μg蛋白，煮沸，蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，使用Western封閉液室內(nèi)封閉3 h，之后加入TBST稀釋的羊抗鼠PI3K、Akt、mTOR、E-cadherin、MMP-9(1 ∶2 500)一抗，并于5 ℃環(huán)境孵育1 d，取出后使用PBS清洗，之后添加二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，取出清洗后進(jìn)行顯色、曝光、成像，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算PI3K、Akt、mTOR、E-cadherin、MMP-9相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖、凋亡能力變化如表1所示，24、48、72 h時(shí)，宮頸癌組、DC組細(xì)胞增殖率、凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細(xì)胞增殖率較低，凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CIK組比較，DC-CIK組細(xì)胞增殖率較低，凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞增殖、凋亡能力變化

2.2 各組細(xì)胞存活率比較如圖1所示，與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細(xì)胞存活率較低，且DC-CIK組細(xì)胞存活率低于CIK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組細(xì)胞存活率比較與宮頸癌組比較：*P<0.05；與DC組比較：#P<0.05；與CIK組比較：△P<0.05

2.3 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較如表2、圖2所示，宮頸癌組、DC組細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組細(xì)胞比較，CIK組、DC-CIK組細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CIK組細(xì)胞比較，DC-CIK組細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較(個(gè)，

圖2 各組細(xì)胞侵襲情況 結(jié)晶紫染色 ×100A：宮頸癌組；B：DC組；C：CIK組；D：DC-CIK組

2.4 各組細(xì)胞凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)量比較如表3、圖3所示，宮頸癌組、DC組PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CIK組比較，DC-CIK組細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 Western blot法檢測(cè)PI3K、Akt、mTOR表達(dá)A：宮頸癌組；B：DC組；C：CIK組；D：DC-CIK組

2.5 各組細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較如表4、圖4所示，宮頸癌組、DC組細(xì)胞E-cadherin、MMP-9相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細(xì)胞E-cadherin相對(duì)表達(dá)量較高，MMP-9相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CIK組比較，DC-CIK組細(xì)胞E-cadherin相對(duì)表達(dá)量較高，MMP-9相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖4 Western blot法檢測(cè)E-cadherin、MMP-9表達(dá)A：宮頸癌組；B：DC組；C：CIK組；D：DC-CIK組

3 討論

有研究[7]顯示，宮頸癌發(fā)病早期臨床特征并不明顯，隨著疾病的進(jìn)展患者可能出現(xiàn)陰道流血、下肢水腫、心慌氣短、皮炎、尿急、陰道排液等情況，進(jìn)而對(duì)生存質(zhì)量、日常生活造成了影響。HPV感染、不良孕產(chǎn)史、性行為等均為宮頸癌發(fā)病主要危險(xiǎn)因素，但目前宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚不清楚[8]。大量臨床研究[9]顯示，DC-CIK細(xì)胞在肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤治療過程中具有較為理想的臨床療效，DC-CIK細(xì)胞可通過分泌IL-12等細(xì)胞因子激活初始T細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答起到了誘導(dǎo)作用，最終發(fā)揮了抗腫瘤的作用。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究[10]顯示，惡性腫瘤的發(fā)展演進(jìn)與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖能力、凋亡能力具有密切聯(lián)系。有學(xué)者研究表明，對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期分布等生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控，能夠抑制癌細(xì)胞不斷發(fā)展擴(kuò)散，這也是臨床治療宮頸癌的關(guān)鍵[11]。本研究顯示，建立DC-CIK共培養(yǎng)體系后對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，宮頸癌細(xì)胞增殖率下降、凋亡率上升，并且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的推移，使用DC-CIK細(xì)胞干預(yù)的宮頸癌細(xì)胞增殖率逐漸下降，凋亡率逐漸上升，細(xì)胞存活率較低，其原因?yàn)?，建立DC-CIK共培養(yǎng)體系干預(yù)，DC-CIK細(xì)胞兼具DC細(xì)胞提呈抗原及CIK細(xì)胞殺滅癌細(xì)胞的作用，因而能夠起到抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、抑制癌細(xì)胞存活率的作用。

研究[12]表明，PI3K/Akt/mTOR通路在細(xì)胞生物學(xué)行為變化過程中能夠發(fā)揮重要作用。PI3K、Akt、mTOR均為PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白，大量實(shí)驗(yàn)研究[13]結(jié)果顯示，抑制PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、mTOR表達(dá)，能夠抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)惡性腫瘤的治療和患者預(yù)后改善具有重要意義。本研究顯示，建立DC-CIK共培養(yǎng)體系后對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，宮頸癌細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR表達(dá)大幅下調(diào)，說明使用DC-CIK細(xì)胞干預(yù)可能通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路表達(dá)，起到干預(yù)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用，由此推測(cè)，DC-CIK干預(yù)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖起到抑制作用的機(jī)制可能是調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)。

大量研究[14]表明，癌組織的不斷發(fā)展擴(kuò)散與癌細(xì)胞侵襲遷移能力有密切聯(lián)系。有研究[15]顯示，抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移能力對(duì)宮頸癌細(xì)胞的發(fā)展擴(kuò)散具有抑制作用。有研究[16]表明，E-cadherin、MMP-9表達(dá)變化與細(xì)胞侵襲、遷移能力密切相關(guān)。本研究顯示，建立DC-CIK共培養(yǎng)體系后對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)下降，且E-cadherin表達(dá)大幅上調(diào)，MMP-9表達(dá)大幅下調(diào)，說明使用DC-CIK細(xì)胞干預(yù)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移能力，其分子機(jī)制可能是因?yàn)槭褂肈C-CIK細(xì)胞干預(yù)能夠調(diào)控細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin、MMP-9表達(dá)。

綜上所述，建立DC-CIK共培養(yǎng)體系，并對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，從而起到誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞休眠的作用，其機(jī)制可能是使用DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)可能調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路蛋白及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，由此推測(cè)，DC-CIK生物細(xì)胞免疫療法可能對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，為宮頸癌的臨床治療研究提供新的方向。