李趁趁，夏 榮，龐詩(shī)夢(mèng)，余金蘭

種植義齒因良好的遠(yuǎn)期穩(wěn)定性成為牙缺失的常規(guī)修復(fù)方式，而預(yù)防種植體周圍疾病的發(fā)生是其長(zhǎng)期存留的關(guān)鍵。Lee et al[1]研究表明種植體周圍疾病的發(fā)病率約為47%，種植體周圍黏膜炎和周圍炎分別約為29.48%和9.25%。種植體周圍炎的發(fā)生與牙周炎相似菌斑生物膜為始動(dòng)因子，牙齦卟啉單胞菌是致病菌[2]。兩段式種植體中，種植體-基臺(tái)連接處的微間隙會(huì)成為細(xì)菌儲(chǔ)存庫(kù)[3-4]，賦予基臺(tái)一定的抗菌能力會(huì)有助于種植體周圍炎的預(yù)防。葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate，CHXG)是臨床常用的抗菌劑之一，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)含有硅氧硅(Si-O-Si)結(jié)構(gòu)，可與鈦表面的羥基官能團(tuán)結(jié)合，聚硅氧烷單元上的烷基鏈可通過(guò)范德華作用力捕獲CHXG[5-7]。該研究通過(guò)浸漬提拉法使PDMS與光滑的鈦表面結(jié)合，然后浸泡在CHXG溶液中，實(shí)現(xiàn)鈦表面抗菌涂層PDMS-CHXG的構(gòu)建并探究不同濃度CHXG的抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器醫(yī)用鈦片(TA1)(寶雞泰宇鑫金屬材料有限公司)；Sylgard 184(聚二甲基硅氧烷，美國(guó)Dow corning公司)；20%葡萄糖酸氯己定溶液(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；牙齦卟啉單胞菌(北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司)；腦心浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)、瓊脂粉、無(wú)菌脫纖維山羊血(上海索萊寶生物科技有限公司)；結(jié)晶紫溶液、抗熒光淬滅劑、氯化血紅素(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；維生素K1注射液(安徽長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司)； DMAO/EthD-Ⅲ活/死細(xì)菌染色試劑盒[翌圣生物科技(上海)有限公司]；HITACHI SU8220冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、LSM880激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)卡爾·蔡司股份公司)；麥?zhǔn)媳葷醿x(上海梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司)；多功能微孔板酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.2 試件制備將直徑12 mm、厚1 mm的60枚鈦片用砂紙逐級(jí)拋光至7 000目達(dá)到基臺(tái)光滑度，分別用丙酮、無(wú)水乙醇及超純水各超聲蕩洗30 min，以去除雜質(zhì)獲取更多-OH，堿化處理，烘干、備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與涂層制備將Sylgard 184以10 ∶1混合于正庚烷溶液中，恒溫磁力加熱攪拌器室溫下攪拌30 min，然后將上述試件放置于溶液中，在超聲震蕩條件下浸泡30 min后均勻提拉取出，超純水超聲波清洗3 min，在60 ℃環(huán)境中烘干。隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組為光滑鈦片；實(shí)驗(yàn)組按CHXG濃度0、0.4、0.8、1.6 mg/ml分為4組，分別記為C、T0、T1、T2、T3。取20%CHXG溶液加入去離子水中，混勻后得到上述濃度的CHXG溶液，將試件浸泡于CHXG溶液24 h后均勻提拉取出，超純水超聲波清洗3 min，烘干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。

1.4 牙齦卟啉單胞菌懸液制備將牙齦卟啉單胞菌菌株劃線接種在BHI瓊脂平板上，在37 ℃厭氧環(huán)境(80% N2、10% CO2、10% H2)培養(yǎng)72 h，挑取單菌落接種于BHI血清培養(yǎng)基中，制備成1.5×108CFU/ml的細(xì)菌懸液。

1.5 抗菌涂層表征在各組中隨機(jī)選取3枚樣品使用CFESEM觀察表面結(jié)構(gòu)的變化，并用X射線能譜對(duì)樣品表面的元素組成進(jìn)行半定量分析。

1.6 抗菌性能檢測(cè)

1.6.1抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn) 取100 μl上述細(xì)菌懸液滴在BHI血瓊脂平板上，用涂布棒均勻涂布至菌液被血瓊脂平板完全吸收，每組隨機(jī)選取3枚樣品將正面輕輕放置于平板表面，使其與瓊脂平板完全接觸，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄。

1.6.2活/死細(xì)菌染色實(shí)驗(yàn) 利用DMAO/EthD-Ⅲ活/死細(xì)菌染色試劑盒鑒別樣品表面活/死細(xì)菌。將DMAO ∶EthD-Ⅲ ∶0.85% NaCl溶液按1.25 μl ∶2.5 μl ∶1 ml的比例配制成熒光染液，避光備用。在超凈工作臺(tái)內(nèi)放入24孔板，每組隨機(jī)選取3枚樣品將受試面朝上置于孔板內(nèi)，取上述細(xì)菌懸液，每個(gè)樣品表面接種100 μl，每孔加入1.5 ml BHI血清培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，棄去舊培養(yǎng)基。用0.85% NaCl溶液清洗5 min，去除未牢固黏附的細(xì)菌，重復(fù)3次。吸取200 μl熒光染液滴于樣品表面，室溫避光孵育15 min，然后用0.85% NaCl溶液清洗并滴加抗熒光淬滅劑，將樣品倒置于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡(×40oil)下觀察。

1.6.3結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn) 每組隨機(jī)選取3枚樣品將受試面朝上置于孔板內(nèi)，接種菌種，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。將樣品置于另一24孔板內(nèi)，PBS清洗去除懸浮細(xì)菌，2.5%戊二醛固定30 min，棄去固定液，并用PBS清洗，加入1 ml 1%結(jié)晶紫溶液振搖20 min，用PBS將游離燃料徹底清洗干凈，加入1 ml 33%醋酸溶液溶解樣品表面結(jié)晶紫染液，充分震蕩后吸取200 μl液體于96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處的吸光度(optical density，OD)值，評(píng)估樣品表面抑制細(xì)菌生物膜形成的能力。

2 結(jié)果

2.1 CFESEM下觀察樣品表征C組鈦片表面相對(duì)光滑，除了方向一致的細(xì)小劃痕外無(wú)其他特殊形貌；實(shí)驗(yàn)組隨著CHXG濃度的增加，樣品表面出現(xiàn)了致密均一的薄膜，表明抗菌涂層使用該方法可在鈦片表面成功構(gòu)建。見圖1。

圖1 CFESEM下各組樣品表面形貌變化 ×500

X線能譜進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見圖2，T0組樣品表面的元素組成主要為C、Si、O，從PDMS的化學(xué)結(jié)構(gòu)式(C2H6OSi)n中可以看出C、Si、O為PDMS涂層的主要組成元素，表明PDMS與鈦片表面的成功結(jié)合；與T0組比較，其他實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果出現(xiàn)了Cl元素，且隨著CHXG濃度的增加所占比例也增加，該分析結(jié)果也表明抗菌涂層PDMS-CHXG在鈦片表面的成功構(gòu)建。

圖2 X射線能譜表面元素半定量分析

2.2 抗菌性能評(píng)價(jià)

2.2.1抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 C、T0組樣品周圍未觀察到抑菌環(huán)；T1-T3組樣品周圍抑菌環(huán)明顯，且抑菌環(huán)直徑隨著CHXG濃度的增大而增大，當(dāng)CHXG的濃度達(dá)到0.8 mg/ml時(shí)表現(xiàn)出良好的抗菌性能。見圖3。

圖3 各組樣品抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2活/死細(xì)菌染色結(jié)果 C組和T0組樣品表面含有大量綠色熒光(活菌)，熒光信號(hào)較強(qiáng)表明細(xì)菌出現(xiàn)了成團(tuán)的黏附生長(zhǎng)；T1-T3組隨著CHXG濃度增大可以觀察到紅色熒光(死菌)的出現(xiàn)且熒光信號(hào)明顯變?nèi)?，在T2、T3組幾乎觀察不到綠色熒光，表明隨著CHXG濃度的增大細(xì)菌黏附聚集生長(zhǎng)現(xiàn)象減少且?guī)缀鯚o(wú)活菌出現(xiàn)。見圖4。

圖4 各組樣品表面活/死細(xì)菌染色免疫熒光結(jié)果 ×40oil

2.2.3樣品表面細(xì)菌數(shù)量 C、T0組的OD值基本一致，隨著CHXG濃度的增大，T1-T3組OD值逐漸減小。ANOVA結(jié)果表明各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5 886.13，P<0.01)。SNK檢驗(yàn)結(jié)果顯示C組與T0組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T2組與T3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T1-T3組與C和T0組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品表面的細(xì)菌數(shù)量組間比較： *P<0.05；與C和T0組比較：#P<0.05

3 討論

種植義齒具有與天然牙極其相似的良好生物特性，成為修復(fù)牙缺失的理想修復(fù)方式。種植體與基臺(tái)的分離設(shè)計(jì)保證了種植體植入牙槽骨發(fā)生骨結(jié)合的過(guò)程中被完全封閉在牙槽骨內(nèi)，避免了其與口腔內(nèi)微生物的接觸，從而保證形成良好的骨結(jié)合[8]，種植體周圍軟組織封閉的形成也會(huì)阻止外界物理和生物刺激的侵入。種植體形成穩(wěn)定的骨結(jié)合后會(huì)行二期手術(shù)而暴露在口腔環(huán)境中，研究[2, 9]表明，早期炎癥在種植體暴露于口腔內(nèi)約3周的時(shí)間就可發(fā)生，軟組織封閉形成的時(shí)間約為基臺(tái)安裝完成后6～8周。二期手術(shù)到終修復(fù)體完成之前，基臺(tái)會(huì)被斷開、重新連接多次使種植體穿齦部位的軟組織封閉被破環(huán)，新的結(jié)合在短期內(nèi)不能形成，口腔內(nèi)的微生物及其代謝產(chǎn)物、食物殘?jiān)缺銜?huì)入侵，基臺(tái)重新連接的過(guò)程中也易將細(xì)菌和其他污染物帶入種植體-基臺(tái)連接處，從而引起種植體周圍炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致種植義齒修復(fù)失敗。因此，增強(qiáng)種植體穿齦部位的抗菌性能及在軟組織封閉形成之前降低感染風(fēng)險(xiǎn)是需要考慮的關(guān)鍵因素。

目前，主要研究的抗菌涂層包括銀離子、銅離子等金屬離子，抗菌肽及廣譜抗生素等，金屬離子可以通過(guò)陽(yáng)極氧化法、微弧氧化法或離子注入法與種植體緊密結(jié)合[10-11]，但抗菌離子容易釋放不足?？咕目咕V廣且具有特異性受體，但其合成費(fèi)用較高，在臨床難以推廣應(yīng)用[12]?？股鼐哂休^強(qiáng)的抗菌性能，可抑制微生物的細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)的合成、干擾DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯，但會(huì)增加機(jī)體耐藥的風(fēng)險(xiǎn)[13]。Wu et al[14]對(duì)N-鹵胺聚合物涂層持久性和抗菌性能研究結(jié)果表明涂層的抗菌功效可持續(xù)存在12～16周，且具有可重復(fù)構(gòu)建性。Lauritano et al[5]和Carinci et al[6]使用1%CHXG醇溶液作為種植體抗菌內(nèi)涂層評(píng)價(jià)了其抗菌性能，結(jié)果表明涂層能夠滅活通過(guò)種植體-基臺(tái)連接處滲透到種植體內(nèi)部的微生物，Carinci et al[6]通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)6個(gè)月時(shí)連接處微間隙內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組微間隙內(nèi)的微生物數(shù)量減少。CHXG作為一種廣譜抗菌劑，具有較強(qiáng)的殺菌和抑菌作用，且不易產(chǎn)生耐藥性，臨床應(yīng)用前景較好，是目前研究的熱點(diǎn)，但與鈦片的結(jié)合涉及復(fù)雜的灌注程序，在臨床難以推廣[15]。

PDMS是應(yīng)用最廣泛的有機(jī)聚合物，具有惰性、無(wú)毒、良好的生物相容性等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇PDMS作為中間層與含有Cl這一鹵族元素的CHXG結(jié)合，通過(guò)簡(jiǎn)單的浸漬提拉法在光滑鈦片表面形成抗菌涂層，制備方法簡(jiǎn)便高效，以期用于臨床基臺(tái)抗菌性能的研究。然而本研究存在一定的局限性，選擇單一菌種進(jìn)行研究不能代表口腔內(nèi)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境；種植體周圍軟組織封閉的形成在種植體周圍炎的預(yù)防中也至關(guān)重要，涂層對(duì)生物學(xué)寬度內(nèi)半橋粒的影響將在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中加以完善；基臺(tái)是臨床上重復(fù)使用的重要配件，因此，涂層構(gòu)建成功后的無(wú)損清除也值得研究。

CFESEM結(jié)果表明抗菌涂層構(gòu)建成功，為了評(píng)價(jià)抗菌能力，進(jìn)行了抑菌環(huán)、活/死細(xì)菌染色及結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)，表明涂層具有良好的抗菌性能，本課題組細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)用牙齦成纖維細(xì)胞驗(yàn)證了其生物相容性良好。種植義齒修復(fù)過(guò)程二期手術(shù)、印模制取、臨時(shí)冠試戴、預(yù)定個(gè)性化基臺(tái)、終修復(fù)完成等涉及基臺(tái)的斷開、連接的操作均可在連接之前涂覆該抗菌涂層，增強(qiáng)其抗菌性能。