李彩紅，朱亮亮，王蓓華，周 恒，李 強，朱昉修，范禮斌

細胞中的氯離子通道在跨膜電位調節(jié)、跨上皮細胞運輸以及細胞器的酸化等方面起著重要的作用[1]。胞內氯離子通道蛋白1(chloride intracellular channel protein 1，CLIC1)是最先被研究分析的人細胞內氯離子通道蛋白，具有核膜和質膜氯離子通道活性[2]。CLIC1在細胞周期調控[3]、細胞器酸化[4]以及細胞遷移[5]等方面起著重要作用。活化蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1，RACK1)蛋白在進化上非常保守，屬于WD重復家族的蛋白，含有7個WD40基序，構成一個β-propeller結構[6]。RACK1可作為支架蛋白參與蛋白質的遷移，從而改變蛋白質的胞內定位來增加或減少蛋白質(酶)的活性，也參與調控蛋白質的翻譯和轉錄因子等的活性[7]。此外，RACK1還可募集激酶和磷酸酶等參與斑點連接的形成[7]。為了探究CLIC1的功能，課題組先前用酵母雙雜交的方法從HeLa細胞cDNA文庫中篩選到一個CLIC1的結合蛋白，即RACK1。該研究用GST-pulldown、免疫沉淀等方法檢測RACK1與CLIC1在體內外的結合情況，觀察二者結合情況。

1 材料與方法

1.1 細胞與質粒本實驗所用的HEK 293T細胞和COS7細胞株、TG1和BL21菌株均為實驗室自存；本實驗所用到的質粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG、pGEX-5X-3-RACK1為先前研究[8]所構建，pcDNA3.1-RACK1-HA為本實驗構建，引物如下：上游CCAAGCTTGGGGCCACCATGACTGAGCAGATGA，下游GATATCCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGG TAGCGTGTGCCAATGGTCA。

1.2 試劑與設備DMEM高糖培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾科技有限公司)；質粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；胎牛血清(澳洲CLARK公司)；胰酶細胞消化液(含EDTA)、細胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、一抗稀釋液、Lipofectamine 8000脂質體轉染試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物有限公司)；質粒小抽試劑盒(美國Axygen公司)；Opti-MEM? Medium(美國Invitrogen公司)；抗體：FLAG(F1804)(美國Sigma公司)；HA(sc-7392)、CLIC1(sc-81873)、RACK1 (sc-17754)、Mouse IgG(sc-52336)(美國Santa Cruz公司)；SuperSignal West Pico顯色試劑盒(美國Pierce公司)；IPTG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、TRITC標記山羊抗小鼠IgG和AF488標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；谷胱甘肽瓊脂糖球珠(美國GE Healthcare公司)；A/G 瓊脂糖球珠(美國Millipore公司)；熒光封片膠(丹麥DAKO公司)；Gelx-1620凝膠成像分析系統(tǒng)(上海Bioshine科學儀器有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(型號：LSM880，德國Zeiss公司)； BSC-II級生物安全柜(美國Thermo公司)；光吸收酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Microfuge 20R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 待HEK 293T或COS7細胞長滿，PBS清洗，胰酶消化收集細胞，以1×105～2×105/cm2的密度接種到含5%胎牛血清的DMEM(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。

1.3.2質粒構建 以pcDNA3.1-RACK1-FLAG質粒為模板，PCR擴增出含有HA標簽的RACK1的CDS序列，并用試劑盒純化回收瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物，用HindIII和EcoRV雙限制酶水解pcDNA3.1載體和純化的PCR產(chǎn)物，然后用T4連接酶將兩者的酶切產(chǎn)物進行連接；連接產(chǎn)物轉化至TG1感受態(tài)細胞中，37 ℃培養(yǎng)約10 h后挑取單克隆并擴大培養(yǎng)抽提重組的質粒，質粒用HindIII、EcoRV雙限制酶酶切鑒定，鑒定正確的質粒送公司測序(通用生物系統(tǒng)有限公司)。

1.3.3質粒轉染 前1 d將細胞接種至六孔板中，使得次日HEK 293T或COS7細胞密度能達到約90%或50%。轉染前，將培養(yǎng)有細胞的六孔板每孔換成2 ml新鮮完全培養(yǎng)液，然后取一個無菌離心管，于待轉染的六孔板中每孔加入所需的Opti-MEM? Medium和目的質粒DNA，再加入適量的 Lipofectamine 8000轉染試劑，混合液均勻滴加到孔內混勻，細胞培養(yǎng)48 h后用于檢測蛋白表達或24 h后用于免疫熒光制片。

1.3.4GST、GST-RACK1的表達及純化 將質粒pGEX-5X-3或pGEX-5X-3-RACK1轉化到BL21大腸桿菌中，挑取單克隆至含有2 ml LB培養(yǎng)基(含氨芐)中37 ℃搖菌過夜。次日取500 μl 菌液到含50 ml LB(含氨芐)擴大培養(yǎng)，至OD600為0.4～0.6；30 ℃下，分別加入適宜濃度的誘導劑IPTG誘導其表達，收集細菌；細菌裂解液裂解，超聲破碎；4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80 ℃凍存。分別取一管上清液離心并加入谷胱甘肽瓊脂糖球珠，于4 ℃混懸孵育2 h，孵育結束后離心棄上清液，沉淀用GST結合緩沖清洗液清洗后備用。

1.3.5GST-pulldown實驗 質粒轉染HEK 293T細胞48 h后，離心收集細胞，然后向細胞中加入適量裂解液，裂解后的上清液加入到純化好的GST或GST融合蛋白，4 ℃混懸孵育4 h，離心收集谷胱甘肽瓊脂糖珠子，珠子中加入SDS上樣緩沖液，變性后進行十二烷基硫酸鈉聚丙酰烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.3.6免疫共沉淀實驗 質粒轉染HEK 293T細胞(內源性免疫沉淀中細胞不轉染質粒)，48 h后收集細胞，然后加入適量細胞裂解液，裂解結束向裂解液中加入適量的FLAG抗體，4 ℃混懸2 h。結束后加入20 μl A/G 瓊脂糖球珠，4 ℃混懸4 h。離心并收集珠子。最后加SDS上樣緩沖液變性，對照樣品(細胞裂解液)直接用SDS上樣緩沖液變性。

1.3.7免疫熒光實驗 質粒轉染后約24 h，取出長有COS7細胞的蓋玻片，用預冷的甲醇固定，然后用1%脫脂牛奶封閉，室溫一抗孵育2 h、二抗孵育1 h(一抗、二抗均用1%脫脂牛奶稀釋，稀釋比例1 ∶100)，DAPI孵育細胞3 min，最后用封片膠封片，4 ℃保存，激光共聚焦顯微鏡觀察拍攝。

1.3.8Western blot法檢測蛋白表達 SDS-PAGE后，凝膠上的蛋白電轉至PVDF膜上(PVDF膜臨用前用甲醇活化)。PVDF膜用脫脂牛奶封閉1.5 h，然后用相關的適量一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，然后再用二抗(1 ∶2 500)室溫孵育1.5 h，最后用ECL試劑盒顯色并在蛋白成像儀上進行拍攝。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-RACK1-HA重組質粒構建以pcDNA3.1-RACK1-FLAG作為模板，用PCR法將RACK1全長cDNA序列構建到pcDNA3.1載體中。構建的重組質粒雙酶切(HindIII、EcoRV)4 h后，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(圖1A)。圖中酶切后的質粒呈現(xiàn)兩條DNA帶，下端的DNA帶分子量與預測的RACK1全長序列分子量一致。構建的質粒送公司測序，測定的序列與RACK1全長序列相同(圖1B)。

圖1 pcDNA3.1-RACK1-HA重組質粒構建A：pcDNA3.1-RACK1-HA重組質粒酶切電泳結果；M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker；1～4：隨機挑取的細菌克隆的質粒DNA；B：pcDNA3.1-RACK1-HA重組質粒中全長RACK1序列測序結果

2.2 CLIC1與RACK1可在體外結合轉染CLIC1-FLAG的HEK 293T細胞經(jīng)裂解后，裂解液與預先純化好的GST和GST-RACK1融合蛋白在4 ℃混懸儀孵育(孵育前取適量裂解液作為對照)，樣品經(jīng)Western blot檢測后，結果見圖2，用FLAG抗體印跡后，細胞裂解液中有較強的CLIC1表達(27 ku)(圖2A，泳道1)。對照組(圖2A，泳道2)無蛋白帶，顯示GST不能結合CLIC1-FLAG；而樣品組中GST-RACK1可以結合CLIC1-FLAG(圖2A，泳道3)。圖2B顯示共孵育溶液中GST(25 ku)(泳道2)和GST-RACK1(62 ku)(泳道3)。此結果表明CLIC1可在體外結合RACK1。

圖2 CLIC1與RACK1的GST-pulldown結果1：pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的細胞裂解液；2：轉染pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的細胞裂解液與已純化的GST共孵育；3：轉染pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的細胞裂解液與已純化的GST-RACK1共孵育

2.3 CLIC1可體內結合RACK1將pcDNA3.1-CLIC1-FLAG與pcDNA3.1-RACK1-HA兩種質粒共轉染至HEK 293T細胞48 h后，裂解細胞，細胞裂解液(Lysates)經(jīng)FLAG抗體孵育和A/G瓊脂糖球珠沉淀后，對蛋白樣品進行免疫印跡，結果見圖3。從圖3中可以看到，F(xiàn)LAG抗體沉淀中存在RACK1(泳道4)，而對照中(泳道3)不存在。此結果表明過表達的CLIC1和RACK1可在HEK 293T細胞中結合。

圖3 RACK1與CLIC1的免疫共沉淀結果1：載體pcDNA3.1和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉的細胞裂解液；2：pcDNA3.1-RACK1-HA和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉的細胞裂解液；3：載體pcDNA3.1和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉的細胞裂解液與FLAG抗體以及A/G瓊脂糖球珠孵育后的沉淀；4： pcDNA3.1-RACK1-HA和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉的細胞裂解液與FLAG抗體以及A/G瓊脂糖球珠孵育后的沉淀

為了確定細胞中內源性的CLIC1和RACK1是否可以結合，本研究直接裂解HEK 293T細胞，裂解液(Lysate)與RACK1抗體孵育(對照與鼠IgG孵育)，然后用A/G瓊脂糖球珠沉淀，最后進行免疫印跡分析。結果(圖4)表明293T細胞均含有豐富的CLIC1和RACK1蛋白(泳道1)，RACK1抗體沉淀中含有CLIC1(泳道3)，而對照抗體沉淀中沒有CLIC1(泳道2)。

圖4 RACK1與CLIC1的內源性免疫沉淀結果1：HEK 293T細胞裂解液；2：鼠IgG和A/G瓊脂糖球珠與細胞裂解液孵育后的沉淀；3：RACK1抗體和A/G瓊脂糖球珠與細胞裂解液孵育后的沉淀

上述實驗證實了在細胞中CLIC1可與RACK1結合。

2.4 RACK1與CLIC1在COS7細胞中的定位蛋白質在細胞中的共定位可為蛋白質之間的結合提供進一步的證據(jù)。為此，本研究在COS7細胞中共轉染了質粒pcDNA3.1-RACK1-HA和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG，轉染24 h后進行免疫熒光制片，并用熒光顯微鏡觀察拍攝。結果表明，在COS7細胞中，CLIC1和RACK1在胞質中具有明顯的共定位(圖5)。

圖5 RACK1與CLIC1在COS7細胞中的共定位 ×400A-C：過表達的pcDNA3.1-RACK1-HA在細胞中的分布；D-G：過表達的pcDNA3.1-CLIC1-FLAG和pcDNA3.1-RACK1-HA的共定位；AF488：綠色(pcDNA3.1-RACK1-HA)；DAPI：藍色(細胞核)；TRITC：紅色(pcDNA3.1-CLIC1-FLAG)；MERGE：疊加

3 討論

RACK1是一個進化上高度保守的蛋白質，主要由7個WD40結構域組成[6]，許多實驗都表明RACK1是一個介導細胞內多種功能的支架蛋白。例如RACK1可以介導蛋白激酶C β轉移到合適的胞內部位，并活化PKCβ[6]；已報道的RACK1結合蛋白基本上都是與RACK1羧端的WD40結構域結合，例如β整合素蛋白、Src激酶等[6]。本研究中過表達免疫沉淀實驗也表明CLIC1與RACK1的羧端結合(結果尚未發(fā)表)。

研究發(fā)現(xiàn)的一類氯離子通道蛋白(chloride intracellular channel，CLIC)家族由7個成員組成，成員之間的序列相同性介于47%～76%[9]，均具有介導氯離子跨膜運輸和谷氧化還原蛋白樣(glutaredoxin-like)活性[10]。不同的CLIC蛋白在細胞內也具有自身特有的功能，例如胞內氯離子通道蛋白4(chloride intracellular channel protein 4，CLIC4)在細胞中過表達可誘導細胞的凋亡[11]。CLIC1含有一個保守的谷胱甘肽-S-轉移酶折疊并具有該酶活性，受到氧化時，CLIC1可形成二聚體并與其通道活性密切相關[12]。CLIC1是作為細胞內的氯離子通道而被分析鑒定的，它可以在人工膜中形成離子通道，其通道活性受到pH的影響。有研究[5]顯示CLIC1可以影響腫瘤細胞的遷移性，而且對其機制有所了解。有研究[13]表明定位于質膜的CLIC1可以募集胞質中的PIP5K1A和PIP5K1C到質膜的前移部位，產(chǎn)生富含PIP2的微結構域以誘導整合素介導的細胞-基質黏附并發(fā)出細胞骨架延伸的信號，啟動“PIP2-talin-integrin”信號通路，促進細胞基質黏附形成和信號轉導，從而在腫瘤轉移過程中對細胞的片狀偽足和絲狀偽足進行時空調控，此結果初步闡明了CLIC1介導腫瘤細胞轉移的一個可能的機制。由于RACK1和CLIC1在細胞質膜上都有分布(本實驗表明CLIC1存在于多種細胞的質膜上)，而且RACK1可以介導蛋白激酶C轉移到質膜并活化蛋白激酶C，這些為進一步研究RACK1和CLIC1在細胞質膜上的關系并探討其功能提供了重要線索。

在血清刺激后，細胞中RACK1表達明顯上調，提示RACK1可能參與細胞周期的調節(jié)[6]，而CLIC1也參與細胞周期中G2/M期的轉變[4]，且在許多腫瘤細胞中CLIC1都是高表達的[14]，因此在未來的研究中有必要詳細解析RACK1和CLIC1的相互作用對細胞周期影響的機制。

本研究利用GST-pulldown、免疫共沉淀以及間接免疫熒光顯微技術證明RACK1與CLIC1可以在細胞中相互結合。