代炆璋，林 麗，陳媛媛，丁凱欣，石 偉，柏兆方，肖小河*

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心肝病醫(yī)學部，北京 100039）

肝纖維化一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，一般是指肝臟受到各種慢性炎癥損傷時出現(xiàn)肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導致細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）過度沉積的一種代償性病理過程，如不及時干預，會逐步發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌[1-2]。 因此，治療肝纖維化對預防肝硬化及肝癌具有重要意義。 然而，目前市面尚無有效治療肝纖維化的藥物[3-4]。

中藥復方制劑具有多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點，近年來在抗肝纖維化方面發(fā)揮了綜合治療的特色和優(yōu)勢，如扶正化瘀膠囊、鱉甲軟肝膠囊、六味五靈片等，具有療效高、副作用小、費用低等優(yōu)點[5-7]。 六味五靈片由五味子、女貞子、連翹、莪術(shù)、苣荬菜、靈芝孢子粉等中藥組成，有研究證實，六味五靈片在臨床上具有良好的抗肝纖維化效果[8]。 本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，六味五靈片可以通過阻止核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）p65 的活化和核因子κB 抑制蛋白（inhibitor κB binding protein, IκB）α的磷酸化發(fā)揮對膽管結(jié)扎（bile duct ligation, BDL）和四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）誘導的肝纖維化動物模型的保護作用[9-11]。 有進一步藥理研究表明，該方中木脂素類成分可以抑制肝星狀細胞（hepatic stellate cells, HSC）-T6 細胞增殖，單體成分五味子乙素（Sin B）已被證明可以通過抑制TGF-β/Smad 信號通路阻斷HSC 的激活，減輕大鼠肝纖維化的進展[12-15]。由于肝纖維化、肝硬化的病理生理機制復雜，不同的動物實驗?zāi)Ｐ筒⒉荒荏w現(xiàn)全部的肝纖維化成因，為了更全面地反映人類肝纖維化的病程發(fā)展特點，本研究擬通過硫代乙酰胺（thioacetamide, TAA）誘導建立大鼠肝纖維化模型，探討六味五靈片對TAA 誘導的大鼠肝纖維化的保護作用，為六味五靈片抗肝纖維化的開發(fā)利用提供科學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20) g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（合格證號：NO.110324200101925524）；飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心動物實驗中心，自由進食及飲水，每天12 h光照/黑暗處理，溫度20～25 ℃，相對濕度為55%～65%。 相關(guān)動物實驗通過中國人民解放軍第五醫(yī)學中心動物倫理委員會審查（倫理編號：IACUC-2020-0033），動物飼養(yǎng)與管理均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。

1.2 實驗藥物與試劑

六味五靈片及空白片(輔料片)，由山東世博金都藥業(yè)有限公司提供（批號：200301）；扶正化瘀膠囊（批號：191003）由上海黃海制藥有限公司提供；硫代乙酰胺（批號：200326335X）購自南京化學試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號：20200410，化學純）、烏來糖（批號：20190419，化學純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉注射液（批號：2007173204）由石家莊四藥有限公司生產(chǎn)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotrans ferase, AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要儀器

超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司，型號：DW-86L728J）；震板儀（海門其林貝爾公司，型號：QB-9002）；酶標儀（美國伯騰儀器公司，型號：BioTek Epoch）；研磨儀（上海靜信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：Tissuelyser-24）；高速低溫離心機（美國Sigma 公司，型號：3-18K）；熒光定量PCR 儀（美國賽默飛公司，型號：Quantstudio 6 Flex）；手掌離心機（杭州奧盛公司，型號：MINI6K）；震蕩器（美國Scientific Industries公司，型號：Vortex-Genie 2）。

1.4 動物造模及給藥

將70 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為7組，設(shè)置正常對照組（N 組）、模型組（M 組）、陽性對照藥扶正化瘀膠囊組（Y 組）、六味五靈片低劑量組（LL 組，202.5 mg·kg-1）、六味五靈片中劑量組（LM組，405 mg·kg-1）、六味五靈片高劑量組（LH 組，810 mg·kg-1）和輔料組（F 組），每組10 只，以1 mL/100 g 給藥，劑量設(shè)置參照文獻和臨床給藥劑量[7-8]。用TAA 誘導化學性損傷肝纖維化模型，除N 組外，其余各組采用腹腔注射3%硫代乙酰胺（TAA,150 mg·kg-1）溶液，每周3 次連續(xù)2 周，第3 周后每周2 次，直至實驗結(jié)束。 N 組注射等體積的相同溶劑；第3 周開始，Y 組、LL 組、LM 組、LH 組、F 組每天灌胃相應(yīng)劑量的藥物，治療藥物混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中；N 組和M 組則灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉，共給藥6 周。

1.5 動物一般情況觀察

對實驗大鼠的外觀體征、行為活動、體質(zhì)量變化進行觀察記錄。

1.6 樣本收集

第6 周給藥結(jié)束時，禁食不禁水12 h，稱重后腹腔注射烏來糖（30%，0.7 mg·kg-1）對大鼠進行麻醉，下腔靜脈取血，1300 g 離心10 min，收集血清用于后續(xù)指標檢測；取肝組織，稱重，將肝大小葉分離，大葉固定在10%中性福爾馬林固定液中用于HE、Sirius red、Masson 染色，小葉保存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)實驗。

1.7 血清生化指標檢測

采用酶標儀法檢測血清中ALT、AST、ALP 水平；ELISA 法測定血清中LN 的水平。

1.8 肝臟組織中mRNA 的表達水平檢測

取出保存于-80 ℃冰箱中的肝組織，稱取30 mg肝組織于EP 管中，按說明加入1 mL Trizol 試劑于勻漿儀中提取總RNA 后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取cDNA模板0.3 μL， 加入Mix 5 μL，DEPC 處理水4.2 μL，正反引物各0.25 μL，共10 μL 體系。置于熒光PCR 儀上進行分析，反應(yīng)條件為95 ℃3 min、95 ℃3 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s、60 ℃1 min、95 ℃15 s。 得到各樣本Ct 值，并以GAPDH 為內(nèi)參，運用公式2-△△Ct計算靶基因的的相對表達量。 引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.9 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，所有實驗數(shù)據(jù)以“±s”表示；采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間比較。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀況觀察

N 組大鼠狀態(tài)良好，行動自如，皮毛光澤較好，飲食和排便正常，體質(zhì)量明顯增加。 M 組大鼠精神明顯萎靡，攝食減少，活動遲緩，皮毛欠光澤；與M組比較，LL 組、LM 組、LH 組及Y 組攝食量增加，精神萎靡和活動遲緩狀況改善明顯。

2.2 大鼠血清中ALT、AST、ALP 水平的變化

與N 組相比，M 組大鼠血清中ALT、AST、ALP水平顯著升高（P＜0.001）；與M 組相比，Y 組、LL 組、LM 組、LH 組血清ALT、AST、ALP 水平均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），且具有一定的劑量依賴性，但F組ALT、AST、ALP 水平同M 組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見表2。

表2 六味五靈片對TAA 誘導的化學性肝纖維化大鼠血清中ALT、AST、ALP 的影響(U·L-1)

2.3 大鼠血清中LN 水平的變化

與N 組相比，M 組大鼠血清中LN 的含量明顯上升（P＜0.001），說明TAA 誘導的大鼠化學性肝纖維化實驗造模成功；與M 組相比，Y 組及LL 組、LM組、LH 組大鼠血清中LN 的含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.001），F(xiàn) 組大鼠血清中LN 的水平同M 組相比，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表3 六味五靈片對TAA 誘導的化學性肝纖維化大鼠血清中LN 的影響

2.4 肝纖維化大鼠肝臟形態(tài)及病理變化

與N 組相比，M 組和F 組大鼠的肝組織粘連嚴重，顏色暗沉無光澤，質(zhì)地明顯變硬，表面粗糙，呈現(xiàn)明顯的彌散性粗顆粒狀，邊緣鈍化。 LL 組、LM 組、LH 組和Y 組大鼠肝臟各葉逐漸分離，粘連減輕，質(zhì)地變?nèi)彳洸⒕哂幸欢ǖ墓鉂伞?HE 染色的結(jié)果顯示，與N 組相比，M 組和F 組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)異常，肝索排列紊亂，肝細胞核形態(tài)改變，炎性細胞及壞死細胞增多；與M 組相比，LL 組、LM 組、LH 組及Y 組大鼠肝臟內(nèi)肝細胞壞死和炎性細胞浸潤均有明顯改善，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。 Masson 和Sirius red染色結(jié)果顯示，與N 組相比，M 組和F 組大鼠肝組織可見較多纖維結(jié)締組織增生，自匯管區(qū)周圍向外延伸，有明顯的假小葉形成；與M 組相比，Y 組、LL 組、LM 組、LH 組肝組織膠原纖維組織增生及纖維化程度均有一定程度的改善，LM 組、LH 組改善尤為明顯，雖然也存在一定的膠原纖維組織增生，但無膠原纖維間隔包繞，程度較模型組明顯減輕，F(xiàn) 組較M組沒有明顯變化，Sirius red 定量分析結(jié)果與上述一致（P＜0.001）。 詳見圖1、表4。

表4 六味五靈片對TAA 誘導的化學性肝纖維化大鼠肝組織Sirius red 定量分析結(jié)果

2.5 對大鼠肝組織中α-SMA mRNA 表達的影響

與N 組相比，M 組大鼠的肝組織中α-SMA mRNA 的表達水平明顯升高（P＜0.001）。 與M 組相比，LL 組、LM 組、LH 組及Y 組均明顯抑制肝組織中α-SMA mRNA 的表達（P＜0.01），但F 組α-SMA mRNA 的水平同M 組相比，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 六味五靈片對TAA 誘導的化學性肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA mRNA 的影響

圖1 六味五靈片對TAA 誘導的化學性肝纖維化大鼠肝組織病理學變化的影響

3 討論

肝纖維化本質(zhì)是機體對肝實質(zhì)損傷的一種修復反應(yīng)，在肝細胞被各種炎性因子侵襲后，由肝細胞、免疫細胞以及血小板分泌的諸如TGF-β1 等細胞因子刺激HSC 持續(xù)增殖和趨化，進而轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞，導致大量的ECM 沉積，誘發(fā)肝纖維化[16-18]。 由于肝纖維化發(fā)病機制復雜，單一環(huán)節(jié)或單一靶點的干預及治療很難取得理想的療效，所以臨床上仍缺乏特異有效的藥物用于治療肝纖維化。 六味五靈片在臨床上是保肝降酶的常用中藥復方制劑，具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點的作用特點，因此，針對病理機制復雜的肝纖維化有著獨特的優(yōu)勢。 TAA 是一種肝毒素，有證據(jù)表明，單劑量給予TAA 可導致肝臟炎癥反應(yīng)和肝纖維化的發(fā)生，可造成明確的肝損傷[19]。TAA 作為最普遍的肝毒性藥物之一，已被廣泛應(yīng)用于肝纖維化動物模型的誘導[20-21]。 與其他實驗?zāi)Ｐ拖啾龋琓AA 誘導的肝纖維化會產(chǎn)生與人類相似的難以逆轉(zhuǎn)的纖維化，是測試潛在抗纖維化藥物的理想模型[19]。課題組前期在BDL 和CCl4誘導的肝纖維化動物模型上發(fā)現(xiàn)了六味五靈片逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用，但肝纖維化的發(fā)病機制復雜，為了更全面地反映人類肝纖維化的病程發(fā)展特點，進一步證實六味五靈片抗肝纖維化的作用，本實驗選擇了TAA 誘導的肝纖維化大鼠模型作為實驗對象，對六味五靈片抗肝纖維化的作用進行了研究。

肝纖維化繼發(fā)于肝損傷，因此當肝纖維化發(fā)生時，會導致血清中ALT、AST、ALP 等評價肝損傷程度的生化指標升高[22-26]。 在本研究中，造模8 周后，模型組大鼠肝臟均出現(xiàn)了損傷和纖維化，血清ALT、AST、ALP 水平顯著升高。經(jīng)不同劑量的六味五靈片和扶正化瘀膠囊治療后，以上血清生化指標及肝組織病理損傷狀況均得到不同程度的改善，且呈現(xiàn)出一定程度的劑量依賴性。 LN 作為一種膜糖蛋白，是基底膜的主要構(gòu)成成分，實驗研究發(fā)現(xiàn)，它與肝纖維化的形成有重要關(guān)系，是肝纖維形成的主要基質(zhì)[27-28]。在正常情況下，肝組織中LN 的含量很低，主要分布在肝膽管和血液中[27]。 但當肝纖維化病情不斷發(fā)展時，機體血清中的LN 含量隨著合成量的增加而不斷增強，并大量沉積在肝竇血管壁上，使肝竇腔變窄，肝竇毛細血管化，進一步導致肝纖維化發(fā)生。 因此，LN 可以作為早期肝纖維化的診斷指標[28]。 本實驗中模型組LN 含量顯著增加，說明肝組織纖維化程度加重，六味五靈片和扶正化瘀膠囊可以降低肝組織中LN 含量，并且具有一定的劑量依賴性，效果明顯，表明六味五靈片可以改善TAA 誘導的大鼠肝纖維化。作為HSC 激活的主要標記物，α-SMA 蛋白在HSC的持續(xù)激活狀態(tài)下表達增加，促使大量以膠原蛋白Ⅰ為主要成分的ECM 產(chǎn)生和沉積，導致肝纖維化的發(fā)生[29-32]。本實驗中六味五靈片和扶正化瘀膠囊可以降低TAA 導致的肝組織中α-SMA mRNA 表達水平的增加，提示六味五靈片可能通過抑制HSC 的激活，改善TAA 誘導的大鼠肝纖維化。

綜上所述，本實驗研究證明了六味五靈片可能通過抑制HSC 的激活發(fā)揮對TAA 誘導的大鼠肝纖維化的保護作用，為六味五靈片增加新適應(yīng)癥以及中藥制劑抗肝纖維化的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。