馮 成，程曉敏，謝一清，康利平，孫璋然，范 旭，耿慧武，劉曉穎

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我國常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率居高不下，急需有效的診斷和治療手段。α-輔肌動蛋白(alpha-actinins, ACTNs)定位于細胞-細胞和細胞-細胞外基質的接觸部位，通過將膜受體與細胞骨架相連來調節(jié)不同信號通路的轉導途徑[1]。α-輔肌動蛋白家族有四個成員，α-輔肌動蛋白-4(alpha-actinin-4, ACTN4)作為成員之一，在細胞中的分布廣泛，并能夠參與多種細胞生命活動，如細胞增殖、細胞運動及上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)等[2-3]。同時，在細 胞信號轉導過程中ACTN4也發(fā)揮著重要作用，如參與核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Wnt / β-catenin等多種信號通路的調控[4-5]。在肝癌細胞中，ACTN4能夠調控AKT/mTOR通路促進癌癥的進展[6]。ACTN4已經(jīng)被證實可以通過影響NF-κB的活性促進腫瘤細胞的遷移能力。該研究在ESCC中探究ACTN4的表達情況及其對細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1試劑與抗體 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM(高糖)培養(yǎng)基和Opti-MEM購于美國GE公司；胎牛血清購于美國CLARK Bioscience公司；胰酶消化液購于德國Bio-Froxx公司；Lipofectamine RNAiMAX和Lipofectamine 2000試劑購于美國Thermo-Fisher公司；一抗稀釋液、青鏈霉素溶液、Western及IP細胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)購自上海碧云天生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；二甲亞砜(DMSO)購于德國Sigma-Aldrich公司；ACTN4、NADH ∶泛素氧化還原酶核心亞基V1(NADH ∶ubiquinone oxidoreductase core subunit V1, NDUFV1)和β-actin抗體購于武漢Proteintech公司。

1.1.2主要儀器 BSC-2級生物安全柜(1300 SERIES A2)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(VIOS160i)(美國Thermo Fisher公司)；倒置光學顯微鏡(TS-100，日本尼康公司)；倒置熒光顯微鏡(Dmil LED，德國Leica公司)；高速冷凍離心機(Allegra 30r，美國Beckman Coulter公司)；恒壓電泳儀(PowerPac Basic，美國BIO-RAD公司)。

1.1.3shRNA ACTN4 shRNA質粒由本實驗室保存，序列見表1。

表1 針對ACTN4的shRNA序列

1.1.4組織和細胞 91例食管鱗狀細胞癌組織于2016—2017年分批取自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普胸外科，經(jīng)胸腹腔鏡根治術切除的食管組織，在確保病理檢測的前提下切取小部分組織分別保存于-80 ℃及福爾馬林固定、包埋。所有患者于術前已閱讀并簽署“組織取材知情同意書”，并上報所在醫(yī)院醫(yī)學倫理部備案。食管鱗狀細胞癌細胞ECA109和人胚胎腎細胞HEK 293T細胞為本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1免疫組化實驗 選取91例ESCC的組織芯片梯度復溫；將組織芯片置于45 ℃二甲苯溶液中脫蠟25 min，重復1次；將組織芯片依次放入100%乙醇10 min，100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，85%乙醇3 min，75%乙醇3 min，雙蒸水1中3 min，雙蒸水2中3 min，梯度脫蠟至水；3% H2O2去除內(nèi)源過氧化氫酶30 min，PBS清洗3次；1%脫脂牛奶封閉30 min；4 ℃孵育一抗過夜，次日PBS清洗3次；室溫孵育二抗30 min，PBS清洗3次；DAB溶液顯色(時間根據(jù)情況而定)，雙蒸水終止反應；蘇木精溶液染核1 min，雙蒸水清洗，烘干后封片，鏡下觀察并委托武漢塞維爾生物技術有限公司進行掃描。

1.2.2免疫組化實驗結果打分細則 對TMA芯片掃描結果進行打分，根據(jù)組織的染色強度和染色數(shù)目不同，將染色強度分為弱染色、中等染色和強染色三個等級，分別計為1～3分；將染色數(shù)目分為0～25%，26%～50%，51%～75%，76%～100%四個等級，分別計為1～4分。將二者相乘可得ACTN4在組織中的相對表達量得分。

1.2.3細胞培養(yǎng) ECA109細胞使用含8%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，HEK 293T細胞使用含8%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)；培養(yǎng)的細胞每2 d更換培養(yǎng)基，細胞匯合度大于90%時進行傳代，使用胰酶消化液對細胞進行消化，用培養(yǎng)基終止消化反應并計數(shù)。

1.2.4shRNA敲低實驗 將HEK 293T細胞以1×106個/孔的數(shù)量接種到6孔板。次日觀察細胞狀態(tài)及匯合度合適即可進行慢病毒包裝，將 shACTN4-1/shACTN4-2/ pLKO.1(空載)、Rev、GAG和VSVG按2 ∶2 ∶2 ∶1的比例用Opti-MEM混合；再以1 ∶1的比例稀釋Lipofectamine 2000試劑，將二者混合靜置15 min；棄去6孔板中的培養(yǎng)基，加入上述混合液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；將ECA109細胞以2×105個/孔的數(shù)量接種到6孔板。第3日觀察ECA109細胞狀態(tài)及匯合度；HEK 293T細胞培養(yǎng)到24 h時，收取培養(yǎng)基離心保留上清液；棄盡ECA109細胞6孔板中的培養(yǎng)基，加入上述上清液并標記為4組：①未處理組(正常培養(yǎng)基)；②pLKO.1組(陰性對照，pLKO.1慢病毒顆粒感染)；③shACTN4-1組(shACTN4-1慢病毒顆粒感染)；④shACTN4-2組(shACTN4-2慢病毒顆粒感染)。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，可通過熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率；若感染效率良好，則將細胞消化后轉移至T25細胞培養(yǎng)瓶中，并用嘌呤霉素(4 μg/ml)藥篩2 d，之后梯度降低嘌呤霉素濃度繼續(xù)藥篩，1周后檢測shRNA敲低效果。

1.2.5Western blot實驗 加入適量Western及IP細胞裂解液(含1% PMSF)裂解細胞，冰上靜置30～40 min；4 ℃、14 000 r/min離心20 min；轉移上清液，Bradfrod法測定蛋白濃度；樣品加入上樣緩沖液沸水浴5～10 min，每個樣品取30 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移蛋白至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST清洗3次，每次10 min；孵育一抗4 ℃過夜，次日TBST清洗3次；再室溫孵育二抗1.5 h，TBST清洗3次；顯影。

1.2.6細胞克隆形成實驗 按照步驟1.2.4中進行操作，轉染后48 h胰酶消化細胞后進行計數(shù)。按照1 000～2 000個/每孔將細胞接種到新的6孔板進行克隆形成實驗，每3 d更換培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)10 d后，觀察單個克隆直徑達到1 mm取出6孔板棄盡培養(yǎng)基，PBS清洗2次，預冷的70%甲醇固定10 min，結晶紫染色20 min，流動水洗去浮色，烘干后拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗重復3次，所有計量資料取小數(shù)點后3位并用表示，使用t檢驗分析兩組結果之間的差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；相關性分析采用斯皮爾曼相關(Spearman)系數(shù)法進行分析，依據(jù)兩列成對等級的各對等級數(shù)之差來進行計算的，相關系數(shù)用ρ表示。

2 結果

2.1 ACTN4在ESCC組織中表達情況ESCC組織與正常食管上皮組織交替排列(n=91)(圖1A)，在ESCC組織中ACTN4呈現(xiàn)普遍的特異性高表達，且主要在細胞質內(nèi)表達；在正常食管上皮組織中ACTN4同樣在細胞質中存在，但表達量較低，并且隨著食管上皮繼續(xù)向表層分化，ACTN4的表達量逐漸減少(圖1B)。TMA芯片打分結果顯示ESCC組織中ACTN4的表達量高于正常食管上皮組織，二者差異有統(tǒng)計學意義(圖1C)。進一步通過Spearman相關系數(shù)對打分結果和病例的病理信息進行統(tǒng)計分析(表2)，結果顯示ACTN4的表達與ESCC病例中臨床病理特征均無相關性，但ACTN4在ESCC組織中的表達量高于正常食管上皮組織。據(jù)此推測ACTN4在ESCC中的表達上調是一個早期事件。

圖1 IHC法檢測ESCC組織中ACTN4的表達A：TMA組織芯片掃描圖；B：ESCC組織和正常食管上皮組織ACTN4 DAB顯色結果；C：TMA組織芯片IHC結果打分柱狀圖；1：ESCC組織；2：正常食管上皮組織；與正常食管上皮組織比較：****P<0.000 1

表2 TMA芯片打分和病理資料間的統(tǒng)計學分析

2.2 ACTN4穩(wěn)定低表達ECA109細胞株的構建熒光顯微鏡觀察慢病毒的感染效率，如圖2A所示，綠色熒光占比可達約85%，表明ACTN4 shRNA慢病毒良好的感染效率。經(jīng)過嘌呤霉素藥篩后，細胞培養(yǎng)至匯合度90%～95%時收集細胞沉淀進行Western blot，結果顯示shRNA敲低組相比于陰性對照組(pLKO.1)ACTN4的蛋白水平降低(圖2B)。該結果表明，ACTN4穩(wěn)定低表達的ECA109細胞株構建成功。

圖2 ACTN4穩(wěn)定低表達的ECA109細胞株的構建A：ECA109細胞感染ACTN4 shRNA慢病毒質粒48 h的感染效率圖；BF：自然光；GFP：綠色熒光；B：ECA109細胞感染ACTN4 shRNA慢病毒質粒嘌呤霉素藥篩后蛋白表達；1：pLKO.1組(陰性對照)；2：shACTN4-1組；3：shACTN4-2組；4：未處理組

2.3 ACTN4 shRNA敲低對ECA109的細胞增殖的影響克隆形成實驗結果顯示，相比于陰性對照組，ACTN4 shRNA敲低組克隆的數(shù)量和大小都有明顯降低(圖3)。該結果提示，敲低ACTN4抑制了ESCC細胞的增殖，即ACTN4能夠促進ESCC的細胞增殖。

圖3 ACTN4穩(wěn)定低表達ECA109細胞克隆形成染色結果1：pLKO.1組(陰性對照)；2：shACTN4-1組；3：shACTN4-2組

2.4 ACTN4 shRNA敲低對NDUFV1蛋白表達的影響利用之前構建的ACTN4穩(wěn)定低表達ECA109細胞株進行Western blot，結果顯示，ACTN4敲低的ECA109細胞中NDUFV1蛋白水平降低。見圖4。

圖4 ACTN4 shRNA敲低下調NDUFV1蛋白表達1：pLKO.1組(陰性對照)；2：shACTN4-1組；3：shACTN4-2組

3 討論

癌癥是威脅人類健康的主要殺手，食管鱗狀細胞癌作為病死率極高的癌癥，深入研究其發(fā)生發(fā)展并尋找有效的診斷和治療手段非常必要。ACTN4屬于肌動蛋白結合蛋白家族，最初被認為是一種與癌細胞運動密切相關的非肌肉型α-肌動蛋白。ACTN4具有許多不同功能，如參與細胞骨架的構建、調節(jié)核轉錄因子的活性及病毒的復制等[7-8]。研究顯示，在多種腫瘤中ACTN4表達升高：在唾液腺癌和舌癌中發(fā)現(xiàn)其基因拷貝數(shù)存在異常，且其基因所在的染色體19q區(qū)域發(fā)生了異常擴增[9]；在結直腸癌和肺癌中ACTN4呈現(xiàn)高表達且與淋巴結轉移存在相關性[10]。ACTN4基因可能作為促癌因子參與某些腫瘤的侵襲、轉移及細胞周期調控。研究[11]顯示，ACTN4能夠與遠端上游元件結合蛋白1(FUBP1)相互作用調節(jié)原癌基因MYC的表達促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展；ACTN4已經(jīng)被證實與EMT密切相關，能夠調控NF-κB信號轉導促進EMT的激活和發(fā)展，從而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。本課題組前期研究[12]表明，在黑色素瘤中ACTN4可以參與調節(jié)受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)的穩(wěn)定性并激活NF-κB從而促進黑色素瘤的細胞增殖。這些研究表明ACTN4在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉移中的重要性。本研究結果顯示ACTN4在ESCC組織中表達上調，但其表達與目前掌握的病理資料中的臨床病理特征無相關性；shRNA技術和克隆形成實驗結果表明，ACTN4敲低抑制ESCC細胞的克隆形成能力，即ACTN4能夠促進ESCC的細胞增殖。表明在ESCC發(fā)生的早期ACTN4就發(fā)生了高表達并通過促進細胞增殖促進ESCC的發(fā)展，且一直持續(xù)到惡性階段，提示ACTN4作為ESCC早期診斷的預測標志物的可能；ACTN4促進細胞增殖的具體機制仍待探究。值得注意的是多項研究[13-14]表明ACTN4可影響細胞周期及細胞遷移能力，從而影響其生物學行為，進一步表明ACTN4可能為潛在的腫瘤治療靶點。

研究顯示，NDUFV1能夠參與線粒體呼吸鏈氧化磷酸化為細胞提供能量的過程，NDUFV1的缺陷是線粒體功能障礙的常見原因，且與肌病、腦肌病和神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病和利氏綜合征)有關[15]；在肺癌細胞中敲除NDUFV1，細胞的存活和耐藥能力顯著降低[16]。本研究表明，在ESCC細胞中ACTN4敲低抑制了NDUFV1的蛋白表達。由此推測，ACTN4敲低所致的NDUFV1表達降低可能導致ESCC細胞內(nèi)線粒體功能障礙，從而抑制ESCC細胞的增殖。這為進一步探究ACTN4在ESCC中的具體分子機制奠定了基礎。

ACTN4參與了不同信號通路的調控，且越來越多的ACTN4相互作用蛋白被發(fā)現(xiàn)，豐富了ACTN4在腫瘤中的蛋白調控網(wǎng)絡及作用機制研究，推動了以ACTN4為靶點的抗癌化合物的研發(fā)。如鞣花酸能夠破壞ACTN4與β-catenin的相互作用從而抑制乳腺癌的轉移[17]。基于不同腫瘤存在異質性及化療藥物存在毒副反應等問題，以及ACTN4可否作為腫瘤治療的靶點仍需進一步探究。