田鵬 鄧云峰 王俊玲 凌曉潔 張真金 王琳

分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核病實驗室病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是開展各項結(jié)核病基礎(chǔ)研究的前提，其優(yōu)點為方法經(jīng)典、敏感度高、特異度強(qiáng)，但其缺少時效性且易受外界和標(biāo)本自身的影響產(chǎn)生雜菌污染造成培養(yǎng)失敗[1]。痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)的質(zhì)量控制要求固體培養(yǎng)法污染率為2%～5%，液體培養(yǎng)法的污染率應(yīng)控制在5%～10%以內(nèi)[2]。與固體培養(yǎng)法相比，液體培養(yǎng)法的污染率可能會更高，而樣本污染率增高將嚴(yán)重影響分枝桿菌培養(yǎng)的成功率以及患者結(jié)核病診斷的時效性[3]。選擇恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本前處理方法[4-12]或?qū)ξ廴竞蟮呐囵B(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行再處理是控制液體培養(yǎng)污染的主要途徑[1,3]。然而，以往研究中提出的再處理方法雖然可以降低液體培養(yǎng)的污染率[1]，但無法提高分枝桿菌的檢出率[3]。因此，液體培養(yǎng)污染后的再處理技術(shù)需要進(jìn)一步改進(jìn)和創(chuàng)新。超聲分散法是將超聲分散技術(shù)應(yīng)用于分枝桿菌液體培養(yǎng)污染樣本再處理的過程，利用超聲波在液體介質(zhì)中產(chǎn)生的“空化”作用，使結(jié)團(tuán)的物質(zhì)在液體介質(zhì)內(nèi)充分分散，并通過與消化劑氫氧化鈉(NaOH)的一系列物理和化學(xué)反應(yīng)，達(dá)到殺滅污染菌、提高分枝桿菌檢出率的目的。筆者通過與不同再處理技術(shù)進(jìn)行對比，對不同再處理技術(shù)培養(yǎng)陽性率和污染率比較分析，優(yōu)化結(jié)核病的實驗室診斷策略，以更好地為臨床醫(yī)生和患者服務(wù)。

材料和方法

一、標(biāo)本采集

根據(jù)《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[13]中痰標(biāo)本收集的要求，連續(xù)收集2020年8月到2021年1月山東省公共衛(wèi)生臨床中心門診和住院的疑似或確診結(jié)核病患者的痰標(biāo)本。本研究共納入5285例患者，疑似肺結(jié)核患者4490例，確診肺結(jié)核患者795例；男性3251例，女性2034例;患者年齡中位數(shù)為41歲。

二、主要試劑與儀器

抗酸染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.8,0.067 mmol/L，自配高壓蒸汽滅菌)、標(biāo)本前處理液A[NALC-NaOH-Na citrate：6% NaOH與2.94% 枸櫞酸鈉1∶1混合，每100 ml加入0.5 g N-乙酰半胱氨酸 (NALC)，自配]、標(biāo)本前處理液B(3% NaOH，自配)、MGIT 培養(yǎng)管(添加劑，抑菌劑，美國BD公司)、MPB64(凱必利，杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)。

顯微鏡(寧波舜宇光學(xué)科技有限公司)、低溫高速離心機(jī)(湖南湘智離心機(jī)儀器有限公司)、BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀(美國BD公司)、超聲分散儀(Scientz 08-Ⅲc，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

三、研究方法

1.分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序：參考《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[2]中的前處理操作程序，取1～2 ml痰標(biāo)本，加入1～2倍標(biāo)本前處理液A，渦旋振蕩30 s，室溫靜置15 min，加入磷酸鹽緩沖液至45 ml，3000×g離心15 min，去上清液留取沉渣，加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液，混勻后取0.5 ml混懸液加入MGIT 培養(yǎng)管，放入全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀。

2.培養(yǎng)陽性與污染認(rèn)定：MGIT 培養(yǎng)管報告陽性后，觀察培養(yǎng)基渾濁程度并進(jìn)行涂片抗酸桿菌染色鏡檢確認(rèn):(1)培養(yǎng)基清澈且鏡檢結(jié)果為抗酸桿菌陽性，則報告液體培養(yǎng)分枝桿菌陽性。(2)培養(yǎng)基渾濁，取一接種環(huán)液體培養(yǎng)基接種于血瓊脂平板并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，如有污染菌生長，無論鏡檢結(jié)果為抗酸桿菌和(或)非抗酸桿菌在本研究中均視為培養(yǎng)污染，記錄并報告污染時間。(3)所有培養(yǎng)陽性標(biāo)本應(yīng)用MPB64進(jìn)行菌種鑒定，檢測線和控制線均出現(xiàn)，報告結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)；控制線出現(xiàn)而檢測線未出，報告非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)；控制線未出現(xiàn)需重新檢測。

3.培養(yǎng)污染樣本分組情況：對5285例疑似或確診結(jié)核病患者的痰標(biāo)本進(jìn)行液體培養(yǎng)，觀察陽性率、污染率以及報告污染時間。將報告污染的MGIT培養(yǎng)管內(nèi)容物充分混勻，并將其均分為2份標(biāo)本，一份納入直接組(259例)，另一份納入超聲組(259例)，兩組分別應(yīng)用直接處理法和超聲分散法進(jìn)行再處理。觀察兩組再處理后培養(yǎng)陽性率和污染率，并比較MTBC與NTM的檢出率。同時觀察兩組中同一份標(biāo)本經(jīng)不同方法再處理后，培養(yǎng)結(jié)果的一致性。

4.培養(yǎng)污染樣本再處理方法：(1)直接處理法：參考分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，應(yīng)用的前處理方法與初次培養(yǎng)一致。(2)超聲分散法：首先設(shè)定超聲分散儀參數(shù)，超聲頻率20 kHz、輸入功率19 W、超聲時間2 min；然后取超聲組標(biāo)本2 ml與標(biāo)本前處理液B按1∶1混合，立即放入超聲分散儀不間斷超聲2 min，隨后室溫靜置10 min，加入磷酸鹽緩沖液至45 ml，3000×g離心15 min，去上清液留取沉渣，加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液，混勻后取0.5 ml混懸液加入MGIT 培養(yǎng)管，放入全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀。

5.質(zhì)量控制：按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[2]中有關(guān)質(zhì)量控制的步驟進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控。本研究中對檢出NTM的患者進(jìn)行重復(fù)NTM培養(yǎng)，排除實驗室污染的可能。

6.統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以“構(gòu)成比或百分率(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗；兩組再處理方法的一致性用Kappa檢驗；Kappa值<0.4認(rèn)為一致性較差，0.4≤Kappa值<0.75認(rèn)為一致性一般，Kappa值≥0.75 認(rèn)為一致性較好。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、初次培養(yǎng)與標(biāo)本污染再處理后培養(yǎng)結(jié)果

5285份痰標(biāo)本初次培養(yǎng)陽性率為17.7%(935/5285)，污染率為4.9%(259/5285)。259例污染結(jié)果中157例(60.6%)患者報告污染時間為1～3 d、100例(38.6%)為4～10 d、2例(0.8%)為11～20 d。直接組與超聲組陽性率分別為7.3%(19/259)和13.9%(36/259)；污染率分別為26.6%(69/259)和21.2%(55/259)；MTBC 檢出率分別為4.2%(11/259)和5.0%(13/259)；NTM 檢出率分別為3.1%(8/259)和 8.9%(23/259)。超聲組培養(yǎng)陽性率高于直接組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.879，P=0.015)；超聲組NTM檢出率明顯高于直接組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.720，P=0.005)；超聲組MTBC檢出率雖然高于直接組，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.175，P=0.676)。超聲組污染率低于直接組，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.078，P=0.149)。

二、兩組中同一份標(biāo)本經(jīng)不同方法再處理后培養(yǎng)結(jié)果一致性比較

兩組中同一份標(biāo)本，直接組和超聲組均報告MTBC 10例、NTM 8例、陰性163例、污染53例；直接組報告污染的標(biāo)本中，超聲組報告MTBC 2例、NTM 10例和陰性4例；直接組報告陰性的標(biāo)本中，超聲組報告MTBC 1例、NTM 5例、污染2例。兩種方法的Kappa值為0.81(P<0.001)，說明兩組培養(yǎng)結(jié)果的一致性較好(表1)。

表1 同一份標(biāo)本再處理后培養(yǎng)結(jié)果一致性比較

討 論

痰標(biāo)本液體培養(yǎng)法與固體培養(yǎng)法相比，優(yōu)點為培養(yǎng)陽性率高且陽性報告周期短，但其污染率偏高，影響了結(jié)核病的實驗室診斷和患者的臨床治療[3]。

國內(nèi)外研究顯示，痰標(biāo)本液體培養(yǎng)法的平均污染率為6.7%[14-21]。本研究中5285例痰標(biāo)本初次液體培養(yǎng)法污染率為4.9%，與國內(nèi)大多研究相符[14-17,19,21]。造成痰標(biāo)本液體培養(yǎng)法污染的原因有很多，例如：口腔雜菌的污染[5]，痰標(biāo)本儲存時間與溫度不當(dāng)[1]，肺部感染患者痰中存在不易被前處理液殺死的細(xì)菌[3]，等等。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)污染后對污染標(biāo)本進(jìn)行去污染再處理，不僅能夠增加陽性檢出率而且能顯著降低污染率，但不同的方法對污染標(biāo)本再處理后的效果不同。

一、直接處理法與超聲分散法的結(jié)果分析

直接處理法是指當(dāng)培養(yǎng)發(fā)生污染后，直接對MGIT培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行去污染再處理，應(yīng)用的前處理方法與初次培養(yǎng)一致。超聲分散法是超聲分散技術(shù)與分枝桿菌培養(yǎng)前處理方法的有效結(jié)合，筆者在前期的研究中報道過，超聲分散技術(shù)是利用超聲波在液體介質(zhì)中產(chǎn)生的“空化”作用，使結(jié)團(tuán)的物質(zhì)在液體介質(zhì)內(nèi)分散[4,7]。將超聲分散技術(shù)應(yīng)用于痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)的前處理中，可以明顯增加去污染效果，在有效殺滅痰標(biāo)本中污染菌的同時可以保持分枝桿菌的活力，使分枝桿菌培養(yǎng)陽性檢出率增高，污染率降低。而Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波可以使病原微生物失活，但失活的效率與微生物的初始濃度無關(guān)，只與微生物的種類有關(guān)。Gao 等[23]在研究中也得出了相同結(jié)論，即超聲波致使不同微生物失活是具有選擇特異性的。這些研究的發(fā)現(xiàn)，均對超聲分散技術(shù)在分枝桿菌液體培養(yǎng)污染標(biāo)本再處理中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

在本研究中，與直接處理法相比，超聲分散法培養(yǎng)陽性率更高。同一患者的污染樣本，經(jīng)超聲分散法再處理后比直接法多檢測出了3例MTBC和15例 NTM。因此，超聲分散法在控制污染的同時可以更好地保護(hù)分枝桿菌的活性。另外，值得注意的一點是，在培養(yǎng)污染的標(biāo)本中，超聲分散法更有利于NTM的檢出。因此，面對全球NTM肺病發(fā)病率的不斷增加[24]，超聲分散法在NTM肺病病原學(xué)診斷方面，與直接處理法相比可能具有巨大的優(yōu)勢。

二、超聲分散法的優(yōu)勢

1.方便快捷，可執(zhí)行性強(qiáng)。在直接處理法中，每份標(biāo)本與前處理液混合后，需要在振蕩器上渦旋振蕩30 s，大量連續(xù)工作會使操作人員手部感到不適。而超聲分散法不僅代替了人工振蕩，且可同時處理數(shù)個標(biāo)本，減少了每個標(biāo)本間消化時間的誤差。

2.避免浪費。直接處理法的標(biāo)本前處理液A中存在NALC與枸櫞酸鈉，有研究指出這兩種試劑在痰標(biāo)本前處理中可以使痰標(biāo)本快速均質(zhì)化，但NALC需要現(xiàn)用現(xiàn)配[15]。而超聲分散法中放棄了NALC與枸櫞酸鈉的使用，節(jié)約了成本且避免了因為NALC需現(xiàn)用現(xiàn)配不能過夜保存等因素所造成的浪費。

3.降低了分枝桿菌活性損傷的風(fēng)險。《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[2]指出，可以適當(dāng)提高NaOH終濃度和增加消化時間控制標(biāo)本中的高污染，但大量的研究表明，隨著NaOH終濃度和消化時間的增加，在殺滅污染菌的同時分枝桿菌的活性也隨之降低[8-12]，而本研究中的超聲分散法，在不增加NaOH終濃度的同時減少了消化時間，從而大大降低了分枝桿菌活性損傷的風(fēng)險。

三、本研究的不足

目前對于超聲分散法再處理技術(shù)的研究，可能還存在以下幾點問題：(1)未排除NALC與枸櫞酸鈉對分枝桿菌活性的影響；(2)并未對分離出的NTM進(jìn)行菌種鑒定；(3)本研究中的超聲分散法和超聲分散的主要技術(shù)參數(shù)為預(yù)實驗中獲得并非最優(yōu)，需要在今后的工作中進(jìn)一步加大樣本量探索優(yōu)化。

綜上所述，超聲分散法具有方便快捷、避免浪費等優(yōu)勢，在控制污染的同時，能更好地檢出MTBC 和NTM，表明超聲分散技術(shù)在分枝桿菌液體培養(yǎng)污染標(biāo)本再處理中具有巨大的應(yīng)用潛能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)田鵬：直接參與(包括：采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù))、文章撰寫(包括：起草文章、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱)；鄧云峰：文章撰寫(對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱)、工作支持(指導(dǎo))；王琳：文章撰寫(對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱)、工作支持(統(tǒng)計分析)；王俊玲：直接參與(采集數(shù)據(jù))、工作支持(統(tǒng)計分析)；凌曉潔和張真金：直接參與(采集數(shù)據(jù))