鄒瑞基 鄒忠晴 熊艷秋 饒進 張麗

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是血液系統(tǒng)第二常見腫瘤，其發(fā)病率日益增加。近年來，在MM 免疫功能障礙和免疫抑制微環(huán)境方面的研究取得了重大進展，調節(jié)性免疫細胞在骨髓微環(huán)境中誘導免疫抑制的機制逐步被闡明[1]。同時，調節(jié)性免疫細胞也開始進入MM 臨床實踐，其數量或比例變化可能有助于MM 早期診斷和療效評估，并補充現有的預后評分系統(tǒng)。單克隆抗體、雙特異性抗體、嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治療等療法使用標志著MM 進入免疫治療時代，患者的預后得到顯著改善，但MM 仍不可治愈，為了延長復發(fā)難治性MM 患者的生存期，闡明抗腫瘤免疫功能障礙的機制和探索新的免疫治療策略至關重要。目前的基礎研究已深入揭示了MM 免疫抑制微環(huán)境的形成及功能狀態(tài)。本文未局限于探討誘導MM 免疫抑制的生物學機制，而是聚焦調節(jié)性免疫細胞在MM 臨床診治中的價值，以期為MM 早期診斷、預后及療效評估提供新的思路，引發(fā)對MM 免疫療法的思考。

1 調節(jié)性免疫細胞參與MM 抑制性免疫微環(huán)境形成

調節(jié)性免疫細胞主要包括調節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Tregs）、調節(jié)性B 細胞（regulatory B cells，Bregs）、骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）等，其功能是抑制其他細胞群對自身或異體抗原的免疫反應，在腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植等領域得到廣泛關注。調節(jié)性免疫細胞在MM 免疫抑制微環(huán)境的形成中發(fā)揮關鍵作用，廣泛參與MM 細胞的免疫逃逸、增殖和耐藥[2]。

Tregs 是CD4+T 淋巴細胞的一個特殊亞群，其特征是在細胞內表達叉頭狀轉錄因子P3（Forkhead box P3，FoxP3），并能進一步分為多種亞型。在MM 免疫微環(huán)境中，Tregs 不僅通過分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）等細胞因子和顆粒酶、穿孔素等溶細胞顆粒抑制效應T 細胞的增殖活化，還可通過其表面的細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）與效應細胞直接結合，從而介導腫瘤免疫逃逸[1]。MM 免疫微環(huán)境中也存在多種生物學機制誘導Tregs 激活和擴增，從而促進抑制性免疫微環(huán)境的形成。研究發(fā)現，促使MM 細胞生存的增殖誘導配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）可顯著促進Tregs 的增殖和存活；MM 細胞通過分泌Ⅰ型干擾素促進Tregs 的活化和擴增[3-4]。人類Bregs 表型被定義為CD19+CD24hiCD38hi，產生IL-10 是識別Bregs 的標記。在MM 患者骨髓微環(huán)境中，IL-10 顯著促進B 細胞增殖，參與B 細胞向漿細胞的最終分化，并且能誘導惡性漿細胞血管生成，有利于MM 的發(fā)病和進展[5]；同時，Bregs能夠抑制自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）針對MM 細胞的抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC），從而導致MM 免疫逃逸[6]。此外，MM 細胞可以誘導骨髓微環(huán)境中MDSCs 的產生，MDSCs 通過抑制效應T 細胞、促進Tregs 增殖、誘導NK 細胞無能等方式促進MM 的免疫耐受和免疫逃逸[7]。MSCs 和TAM也作為具有免疫抑制作用的調節(jié)性免疫細胞，其與MM 細胞的相互作用促進了腫瘤細胞增殖、擴散、耐藥性產生以及骨髓瘤骨病的發(fā)生。在免疫治療的背景下，調節(jié)性免疫細胞亟待從基礎研究走入臨床實踐。

2 調節(jié)性免疫細胞在MM 中的臨床價值

2.1 Tregs 在MM 診斷、治療、預后預測中的價值

對于新診斷多發(fā)性骨髓瘤（newly diagnosed multiple myeloma，NDMM）患者，疾病的異質性使得在治療反應和生存方面存在較大差異。因此，個體化危險分層至關重要，Tregs 可能成為新的預后標志。多項研究發(fā)現外周血Tregs 增高與疾病負荷相關，國際預后分期（international staging system，ISS）Ⅲ期患者Tregs 較Ⅰ、Ⅱ期增高，并且外周血Tregs 增高的患者疾病進展時間（time to progression，TTP）及總生存期（overall survival，OS）更短[8-10]。最近的研究發(fā)現，擁有更高骨髓Tregs 比例（＞3.31%）的NDMM 患者無進展生存期（progress-free survival，PFS）顯著縮短，并伴隨以高表達PD-1 為特征的CD4+效應T 細胞（CD4effPD-1hi），CD4effPD-1hi增高和CD4eff/Tregs 降低是MM早期復發(fā)的獨立預測因素[11]。Kitadate 等[12]提出，MM 復發(fā)患者外周血CD38+Tregs 數量明顯高于意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of unknown significance，MGUS）、無癥狀骨髓瘤（smoldering multiple myeloma，SMM）、NDMM 組，提示CD38+Tregs 在骨髓瘤的進展中發(fā)揮重要作用。目前，多數研究認為MM 患者骨髓與外周血Tregs 比例通常增加，且Tregs 水平與更高的進展風險相關；Tregs 變化與MM 疾病狀態(tài)、進展和預后無顯著關聯，這種差異可能是由于不同中心對于Tregs 分選以及實驗方法不同所致，今后還需更大樣本量的研究來探索Tregs 對于MM 預后分層的作用。

MGUS 被認為是MM 發(fā)展過程中的初始階段，并可進展為一種更接近MM 的狀態(tài)，即SMM。絕大部分MGUS/SMM 患者可保持長期疾病穩(wěn)定狀態(tài)，通常認為這類患者無需治療，而識別其中的高危人群，采取早期干預措施，是延緩向MM 進展的重要手段[13]。Marsh-Wakefield 等[14]對MGUS 和NDMM 患 者中CD39-Tregs 亞群進行區(qū)分，發(fā)現CD45RO+CD49d+CD62L+和CD69+CD62L-CD49d-亞群主要在NDMM患者中出現，可作為區(qū)分MGUS 和NDMM 的指標，并推測這種差異可能促進了惡性漿細胞的生長，代表MGUS 向MM 轉化的關鍵免疫改變。Wang 等[15]也通過對MGUS 患者、NDMM 患者和健康志愿者外周血與骨髓中Tregs 進行分析，發(fā)現MM 患者CD4+CD28-FoxP3+Treg 樣細胞明顯高于MGUS 患者。CD4+CD28-FoxP3+Treg 樣細胞是一種新發(fā)現的調節(jié)性T 細胞亞群，其可能參與導致MGUS 進展為MM 的免疫受損。了解這些Tregs 亞群的調控特性有助于識別MM 進展高危人群，實現MM 早期診斷與治療。

免疫調節(jié)劑（immunomodulatory drugs，IMiDs）和蛋白酶體抑制劑（proteasome inhibitor，PI）已成為MM 治療的基石，Tregs 作為免疫微環(huán)境的生物標志物，在療效評估價值也有待被發(fā)掘。有研究發(fā)現在38 例對BRD 方案（硼替佐米、來那度胺、地塞米松）誘導治療有反應的NDMM 患者中，達到完全緩解（complete remission，CR）的患者總Tregs 水平較低，但CTLA-4+DR+終末效應Tregs 水平顯著升高[8]。也有研究發(fā)現18 例患者經RD 方案治療后，外周血Tregs 比例降低，且療效在非常好的部分緩解（very good partial remission，VGPR）以上的患者更顯著，提示Tregs 與應答質量相關[16]。在達到部分緩解（partial remission，PR）以上療效患者的維持治療中，Nozaki 等[17]研究發(fā)現，在含來那度胺方案治療3 個月和6個月時，患者外周血CD45RA-CD4+FoxP3hi效應Tregs（effector Tregs，eTregs）較基線值均顯著增加，進一步對eTregs 免疫表型分析發(fā)現，其中糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）陽性eTregs 比例降低，并且這種改變在VGPR 療效以上患者中更為明顯。因此，推測GITR+eTregs 可能起到功能性Tregs 的作用。未來亟需精確分析Tregs 亞型，以期預測臨床結局，針對不同免疫特征實施個體化治療策略。

免疫治療的應用為復發(fā)難治性MM 患者帶來了希望，尋找新的免疫靶標是當前的重點方向。通過靶向作用于Tregs 從而改善宿主抗腫瘤免疫應答，有望成為MM 新的治療方法。CD38 單抗daratumumab 的問世標志著MM 進入免疫治療時代。研究發(fā)現，經daratumumab 治療的MM 患者骨髓和外周血CD38+Tregs 顯著減少，同時伴隨著效應T 細胞數量及活性的增加，提示腫瘤微環(huán)境中免疫抑制的減輕[18]。并且，循環(huán)CD38+Tregs 數目較高的患者對daratumumab 有更持久應答，治療前CD38+Tregs 水平可能是daratumumab 療效的預測因素[12]。信號傳導淋巴細胞活化分子家族成員7（signaling lymphocyte activated molecular family 7，SLAMF7）單抗elotuzumab 是第二種獲批MM 免疫治療的藥物，除了能夠通過NK 細胞介導殺傷MM 細胞，最近還有研究發(fā)現能通過消除SLAMF7+CD8+Tregs 促進抗腫瘤免疫的恢復[19]。

2.2 Bregs 在MM 診斷、治療、預后預測中的價值

近年來，Bregs 在MM 免疫微環(huán)境中的作用開始得到關注，深入了解Bregs 與MM 發(fā)病和進展的關系，并探索相關免疫學機制，可能是MM 早期診斷、預后評估和靶向干預的潛在途徑。本研究前期工作[6]首次通過流式細胞術從MM 患者骨髓樣本中確認了CD19+CD24hiCD38hiBregs，并發(fā)現MM 患者外周血Bregs 比例與健康人無顯著性差異，而NDMM 患者骨髓和外周血Bregs 比例明顯高于緩解后維持治療者。有小樣本量研究顯示，在MGUS 向MM 的轉變中，骨髓Bregs 比例開始增加，而在MM 進展過程中趨于下降[20]。Bartosińska 等[21]研究發(fā)現，隨著疾病分期的增加，骨髓中Bregs 的比例呈下降趨勢，ISS Ⅲ期患者骨髓Bregs 的比例顯著低于ISS I 期患者，并且Bregs 產生IL-10 的水平與疾病嚴重程度相關，ISS Ⅲ期患者Bregs 所產生的IL-10 顯著升高。

目前，MM 常用的分期系統(tǒng)結合生化指標和細胞遺傳學，反映了機體腫瘤負荷，卻不能體現免疫微環(huán)境異常的因素，在MM 患者診治流程中納入Bregs 分析，有望構建更加精準的危險分層模型。在一項NMDD 患者的真實世界研究中，研究者分析Bregs 與臨床特征的關系，發(fā)現骨髓CD19+B 細胞中CD19+CD24hiCD38hiBregs＜10%患者有更短的OS，并且PFS 也呈縮短的趨勢，但不同分期NDMM 患者Bregs 比例差異無統(tǒng)計學意義。同時，Bregs 在CD19+B 細胞中的百分比也與骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）中CD19+B 細胞的比例呈正相關。推測更高的Bregs 提示更高的B 細胞比例，反映了機體免疫功能，與患者更佳的生存結局相關[22]。同一中心還研究了PET-CT 聯合Bregs 比例預測治療反應和生存結局的作用，分析52 例基于BD 方案誘導的患者治療前的骨髓樣本，其中Bregs 相對于CD19+B 細胞中位比值為7.5%（1.1%～27.2%）。24 例（46.2%）患者Bregs 比例＜10%，并且PFS 和OS 更短，這些患者經誘導治療，23.1%無法達到PR，而Bregs≥10%的患者均達到PR 及以上療效。研究者同時發(fā)現，基線PET-CT 最大標準攝取值（maximum standard uptake value，SUVmax）＞4.2 并且Bregs 比例＜10% 能作為高危NDMM 患者的分層指標，提示更差的治療反應和PFS、OS[23]。需要進行更大樣本量和長時間隨訪的研究，進一步證實Bregs 在NDMM 患者預后與療效評估中的價值。

特別值得關注的是，daratumumab 治療復發(fā)難治性MM 可快速使CD19+CD24hiCD38hiBregs 下降[24]。消除具有免疫抑制作用的Bregs，可能改變MM 免疫微環(huán)境，重新激活免疫系統(tǒng)抗腫瘤功能，增強CD38 單抗、SLAMF7 單抗以及其他免疫療法對MM 細胞的活性。前期的研究也發(fā)現Bregs 可以抑制NK 細胞介導的針對MM 細胞的ADCC 作用[6]，而上述提到的Bregs 比例高提示NDMM 患者更好的生存和療效，可能與Bregs 的免疫抑制作用相矛盾，推測由于Bregs比例高的患者B 細胞總數也高，其免疫抑制狀態(tài)較輕，并且真正具有免疫抑制作用的Bregs 可能為其中一部分。未來的研究需進一步分析Bregs 的各種亞型以及在MM 不同階段的作用，并探索新的免疫治療靶點。

2.3 其他調節(jié)性免疫細胞在MM 中的臨床價值

MDSCs、MSCs、TAM 等調節(jié)性免疫細胞也參與MM 的發(fā)展，具有治療及預后意義。MDSCs 是骨髓來源的一群異質性細胞，正常情況下能分化為樹突狀細胞、巨噬細胞和成熟粒細胞，而在腫瘤、炎癥等病理狀態(tài)下則分化受阻，成為具有負性免疫調控作用的細胞群體。MDSCs 主要有兩個亞群：單核MDSCs（monocyte MDSCs，M-MDSCs）和粒細胞MDSCs（granulocyte MDSCs，G-MDSCs），人類M-MDSCs 表型被定義為CD33+CD11b+HLA-DRlow/-CD14+，G-MDSCs 為CD33+CD11b+HLA-DRlow/-CD15+[25]。MDSCs 的水平與MM 疾病嚴重程度和治療反應相關。研究發(fā)現，ISS Ⅲ期和腎功能損害患者外周血M-MDSCs 水平明顯升高，硼替佐米治療后M-MDSCs 顯著降低[26]；復發(fā)難治性患者經3 個周期RD 方案治療后，M-MDSC 頻率增加與未能達到VGPR 及以上療效有關[27]。骨髓G-MDSCs 比例低的患者腫瘤負荷也較低（ISSⅠ/Ⅱ期），且G-MDSCs 增高提示OS 更短[28]。MDSCs 水平升高提示不良預后，抑制MDSCs 在MM 中的功能可能是具有前景的免疫治療策略。

MSCs 是骨髓中主要的干細胞群體，MM 患者的MSCs 表現出異常的細胞因子分泌水平和基因表達特點，對MM 細胞增殖具有促進作用，而MM 細胞與MSCs 的相互作用也可誘導MSCs 生長和獲得異常表型，這可能有助于MM 免疫微環(huán)境的發(fā)展和骨病的發(fā)生[29-30]。已有研究發(fā)現，MSCs 基因表達模式可以將MM 患者與MGUS、SMM 以及健康對照者區(qū)分，基于3 個MSCs 特異性基因COL4A1、NPR3 和ITGBL1 的表達，能夠預測MGUS/SMM 患者向MM 的進展以及MM 患者的PFS，COL4A1 過表達、NPR3和ITGBL1 低表達提示不良預后[31]。成骨分化能力受損是MM-MSCs 的顯著特征，通過靶向骨髓MSCs 改善MM 誘導的骨損傷是近年來的研究熱點，體外實驗已發(fā)現多種靶向MSCs 的分子能調節(jié)MSCs 成骨分化，改善MM 骨質破壞[30]。

此外，以表達CD163 為特征的TAM 也與MM預后密切相關，其數量增多提示較差的臨床特征、治療反應和PFS、OS[32-34]，有助于在初診時識別高危患者和補充現有的預后評分系統(tǒng)。

調節(jié)性免疫細胞在MM 中的臨床研究尚處在起步階段，其對于MM 診斷、治療、預后的重要價值尚在認識階段。Tregs、Bregs、MDSCs、MSCs、TAM 作為MM 免疫微環(huán)境中主要的調節(jié)性免疫細胞群體，其數量及功能變化是腫瘤演變情況的反映指標，具有診斷、治療、預后的相關臨床價值。總結近5 年調節(jié)性免疫細胞在MM 患者中臨床意義的研究，見表1。

表1 近5 年調節(jié)性免疫細胞在MM 患者中臨床意義的研究匯總

表1 近5 年調節(jié)性免疫細胞在MM 患者中臨床意義的研究匯總 （續(xù)表1）

3 結語與展望

在MM 患者診療過程中納入對骨髓和外周血調節(jié)性免疫細胞的分析，可能是早期診斷、高危患者干預及個體化治療的途徑。目前，調節(jié)性免疫細胞在MM 中的臨床意義多局限于單中心、小樣本量研究，對調節(jié)性免疫細胞的分選及各種亞型的定義也缺乏統(tǒng)一標準。經歷了傳統(tǒng)化療和靶向新藥時代，免疫治療已成為MM 最具潛力的治療策略，未來還需要高質量的基礎和臨床研究來進一步揭示調節(jié)性免疫細胞在MM 中的復雜作用機制，并探索針對調節(jié)性免疫細胞的新治療策略，以期突破MM 慢性進程中復發(fā)難治的瓶頸。