簡淑儀 喬 莉 周穎儀 劉瀟瀟

廣東省藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510663

橘紅痰咳煎膏是由化橘紅、蜜百部、茯苓、半夏(制)、白前、甘草、苦杏仁和五味子共八味藥組成的復方制劑，其中的化橘紅具有化痰止咳、散寒燥濕、健胃利氣的功效[1],為方中君藥；五味子與化橘紅、半夏相伍，防其燥散傷正之虞，苦杏仁降肺氣之中兼有宣肺止咳定喘之功[2]，兩者均為佐藥。橘紅痰咳煎膏現(xiàn)行質(zhì)量標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十八冊(標準號：WS3-B-3522-98)，檢驗項目僅包括3個化學鑒別反應、相對密度及煎膏劑項下的檢查項目[3]，缺少對處方中藥味的定性鑒別方法和君藥的定量檢測方法，質(zhì)量標準的可控性較差。張家瑞[4]以柚皮苷為指標性成分，研究建立了處方中化橘紅的含量測定方法；宋麗軍等[5]則研究建立了處方中茯苓和化橘紅的薄層鑒別方法，同樣以柚皮苷為指標性成分，對化橘紅的含量測定方法作進一步優(yōu)化。相關(guān)研究[6]表明，化橘紅含有黃酮、多糖、香豆素、揮發(fā)油等多種化學成分，而黃酮類化合物是化橘紅的主要有效成分，其中最主要是柚皮苷和野漆樹苷，二者含量之和占化橘紅黃酮類物質(zhì)總量的84%以上[7]，已有相關(guān)文獻研究建立化橘紅及其飲片、湯劑中柚皮苷和野漆樹苷的含量測定方法[8-11]。為了進一步完善橘紅痰咳煎膏的質(zhì)量標準，本研究在國家藥品標準提高科研專題的要求下，采用TLC法對處方中五味子和苦杏仁進行定性鑒別，采用HPLC法對制劑中的柚皮苷和野漆樹苷含量進行測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀為日本島津LC-20AT，包括CBM-20A、DGU-20A5R、CTO-20AC、SIL-20AC、SPD-M20A和LabSolution工作站；電子分析天平分別為德國Sartorius CP225D十萬分之一型和CP224S萬分之一型；美國MILLIPORE Milli-Q純水處理系統(tǒng)；美國必能信M8800H-C型超聲波清洗儀。

1.2 試驗材料

1.2.1 對照物質(zhì) 詳細信息見表1。

表1 對照物質(zhì)信息

1.2.2 試劑 硅膠G薄層板購于德國默克公司；色譜純甲醇購于Honeywell公司；水為超純水；中性氧化鋁購于上海五四化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純，均購于廣州化學試劑廠。

1.2.3 樣品 市售12批次橘紅痰咳煎膏樣品，編號S1～S9購于廣東化州中藥廠制藥有限公司，編號S10～S12購于廣州白云山和記黃埔中藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 五味子 取本品15 g，加水50 mL，超聲使混合均勻，用三氯甲烷振搖提取2次，每次40 mL，離心使分層，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，4g，內(nèi)徑為1.5 cm，用甲醇預洗)上，用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液；取五味子對照藥材0.25 g，加水50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液用三氯甲烷振搖提取2次，每次40 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液；取五味子醇甲對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液；按橘紅痰咳煎膏處方和制法制備缺五味子陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成缺五味子陰性樣品溶液。吸取供試品溶液和缺五味子陰性樣品溶液各10 μL，對照藥材溶液和對照品溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(3∶2∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果供試品色譜中在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性樣品無干擾，色譜圖如圖1所示。12批供試品測定結(jié)果如圖2所示。

2.1.2 苦杏仁 取本品10 g，加水20 mL，超聲使混合均勻，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為2 cm，柱高為16 cm)，用水洗脫至無色，棄去水液，再用20%乙醇150 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液；取苦杏仁苷對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液；按橘紅痰咳煎膏處方和制法制備缺苦杏仁陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成缺苦杏仁陰性樣品溶液。吸取供試品溶液和缺苦杏仁陰性樣品溶液各10 μL、對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10 ℃放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，且陰性樣品無干擾，色譜圖如圖3所示。12批供試品測定結(jié)果如圖4所示。

2.2 化橘紅含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil 100-5-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相為甲醇-醋酸-水(30∶4.3∶65.7)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長0～35 min為282 nm(柚皮苷)、35～60 min為337 nm(野漆樹苷)；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2.2 混合對照品儲備液和系列混合對照品溶液的制備 分別取柚皮苷和野漆樹苷對照品適量，精密稱定，用甲醇制得混合對照品儲備液(每1 mL含柚皮苷475.923 μg和野漆樹苷20.227 μg)；精密量取上述混合對照品儲備液適量，用甲醇制成每1 mL含柚皮苷和野漆樹苷分別為：380.738 μg和16.182 μg、237.962 μg和10.113 μg、142.777 μg和6.068 μg、47.592 μg和2.023 μg、28.555 μg和1.214 μg的系列混合對照品溶液。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 分別取柚皮苷和野漆樹苷對照品適量，精密稱定，用甲醇制得混合對照品溶液(每1 mL含柚皮苷374.595 μg和野漆樹苷15.170 μg)。

2.2.4 供試品溶液的制備 取本品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)15 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 陰性樣品溶液的制備 按橘紅痰咳煎膏處方和制法制備缺化橘紅陰性樣品，取0.5 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制得缺化橘紅陰性樣品溶液。

2.2.6 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按擬定方法測定，記錄色譜圖。結(jié)果如圖5所示。供試品色譜中，各待測成分與鄰峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)按柚皮苷峰計算大于5000，且缺化橘紅陰性樣品無干擾，表明該方法專屬性良好。

A.對照品；B.供試品；C.缺化橘紅陰性樣品； 1.柚皮苷；2.野漆樹苷圖5 含量測定專屬性試驗液相色譜圖

2.2.7 線性關(guān)系考察 取混合對照品儲備液和系列混合對照品溶液，按擬定方法測定，以進樣量(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如表2和圖6所示，表明柚皮苷進樣量在0.28555～4.75923 μg的范圍內(nèi)、野漆樹苷進樣量在0.01214～0.20227 μg的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表2 柚皮苷和野漆樹苷線性關(guān)系考察

圖6 柚皮苷和野漆樹苷線性關(guān)系圖

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，按擬定方法，分別于0 h、10 h、20 h、30.5 h、38 h、48 h、60.5 h進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果柚皮苷和野漆樹苷峰面積的RSD分別為0.5%和1.3%(n=7)，表明供試品溶液在60.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 精密度試驗 取混合對照品溶液，按擬定方法連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果柚皮苷和野漆樹苷峰面積的RSD均為0.2%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.10 重復性試驗 取同一批供試品(編號：S7)，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按擬定方法測定。結(jié)果柚皮苷和野漆樹苷的平均含量分別為9.69975 mg·g-1和0.28245 mg·g-1，RSD分別為0.3%和0.7%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.11 回收率試驗 取已知含量的同一批供試品(編號：S7)0.25 g，共9份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分低、中、高3個水平進行加樣回收率考察，每個水平各取3份，3個水平加入柚皮苷和野漆樹苷混合對照品溶液的濃度分別為0.15442 mg·mL-1和0.00405 mg·mL-1、0.10316 mg·mL-1和0.00256 mg·mL-1、0.05152 mg·mL-1和0.00132 mg·mL-1，加入量均為25 mL，按供試品制備方法分別制成加樣回收溶液，按擬定方法測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果見表3，表明該方法準確度良好。

表3 柚皮苷和野漆樹苷加樣回收試驗結(jié)果

2.2.12 樣品含量測定 取12批樣品，依法制備供試品溶液，按擬定方法進行測定，計算樣品中柚皮苷和野漆樹苷的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品中柚皮苷和野漆樹苷含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 定性鑒別

3.1.1 五味子薄層色譜鑒別方法學考察 樣品的前處理過程考察過采用D101大孔樹脂吸附柱除去雜質(zhì)，但色譜效果的重現(xiàn)性較差，背景干擾比較嚴重，易造成陰性有干擾的判斷。方法學考察中分別比較了采用不同品牌的薄層板、在不同溫濕度下展開的分離效果，結(jié)果顯示重現(xiàn)性均較好。

3.1.2 苦杏仁薄層色譜鑒別方法學考察 對樣品前處理過程中的乙醇洗脫液進行了不同濃度和不同洗脫體積的考察，結(jié)果顯示采用20%乙醇溶液150 mL洗脫時，色譜主斑點清晰，背景干擾較少，目標成分洗脫完全。方法學考察中分別比較了采用3種不同品牌的薄層板、在不同溫濕度下展開的分離效果，結(jié)果只有采用德國默克公司的薄層板時，色譜分離度良好，色譜斑點集中且清晰，不同溫濕度下的試驗結(jié)果基本一致。

3.2 定量測定

3.2.1 色譜條件的選擇 流動相的選擇參考《中國藥典》2020年版一部收載的“化橘紅”質(zhì)量標準[12]，對流動相比例進行適當調(diào)整。采用二極管陣列檢測器對混合對照品溶液在190～500 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，確定柚皮苷和野漆樹苷的最大吸收波長分別為282 nm和337 nm，因此采用該兩個波長作為檢測波長。

3.2.2 供試品前處理方法的考察 考慮到樣品含糖量較高，嘗試采用通過D101大孔樹脂吸附柱、通過中性氧化鋁柱、加熱回流不同時間和超聲提取不同時間對樣品進行前處理，并對提取溶劑和取樣量進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)取樣量為0.5 g，采用甲醇作為提取溶劑，超聲處理 15 min就能達到較好的除去雜質(zhì)的效果，色譜峰形比過柱的效果更理想。

3.2.3 色譜柱的比較 分別比較了Kromasil 100-5-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、phenomenex Luna?C18(2)(5 μm，4.6 mm×250 mm)和YMC Hydrosphere C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)等3種不同品牌色譜柱的分離效果和測定結(jié)果，均無明顯差異。由于同一成分在不同品牌色譜柱中的保留時間差異較大，因此應根據(jù)實際情況，調(diào)節(jié)檢測波長的切換時間。

3.2.4 限度制定的討論 由于此次研究收集到的樣品批次較少，而且未收集到藥材及相關(guān)批次成品的轉(zhuǎn)移率數(shù)據(jù)，建議積累更多批次樣品的測定結(jié)果，并考察轉(zhuǎn)移率后再制定合適的限度。

3.3 結(jié)論 本文研究采用TLC法對橘紅痰咳煎膏處方中的佐藥五味子和苦杏仁進行定性鑒別，專屬性強，重現(xiàn)性好；采用HPLC結(jié)合波長切換的方法，同時測定君藥化橘紅中柚皮苷和野漆樹苷的含量，既能提高對目標化合物檢測的準確性，又能簡化數(shù)據(jù)處理過程、提高工作效率。查閱資料顯示，目前已見有關(guān)橘紅痰咳方的文獻均未對五味子和野漆樹苷進行質(zhì)量控制，本文的研究項目既能有效提高橘紅痰咳煎膏的質(zhì)量可控性，也能為統(tǒng)一橘紅痰咳方的質(zhì)量標準奠定研究基礎(chǔ)和提供技術(shù)支持。