盧禮平 王 歡 熊 玲 楊 桃 潘 婷 唐靖雯 潘 梅*

1.貴州威門(mén)藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550018；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610041

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖。其味甘，性微寒，歸胃、腎經(jīng)。具有益胃生津、滋陰清熱功效，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨痿軟[1]。主要含有多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、芪類(lèi)、黃酮類(lèi)、茐酮類(lèi)、苯丙素類(lèi)、甾體類(lèi)等成分，其中鐵皮石斛主要的特征成分為石斛多糖[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)[3]證明鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂等作用。鐵皮石斛葉為加工鐵皮石斛鮮條(楓斗)的副產(chǎn)品[4]，研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛葉在化學(xué)成分種類(lèi)上與莖相似，僅各成分含量不同。2018年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委將鐵皮石斛葉作為新食品原料終止審查，審查意見(jiàn)為“鑒于該產(chǎn)品具有地方傳統(tǒng)食用習(xí)慣，建議按照《食品安全法》第29條管理，終止審查”[7]，即鐵皮石斛葉可作為地方特色食品管理。本研究擬通過(guò)對(duì)鐵皮石斛葉進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)(細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、體外哺乳細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn))、90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)和大鼠致畸試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)鐵皮石斛葉毒性和安全性，旨在為貴州省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)“鐵皮石斛葉”的建立提供理論支撐。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 SPF級(jí)SD大鼠(20只，雌雄各半)、SPF級(jí)健康性成熟的未交配SD雄鼠和雌鼠，均由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；SPF級(jí)昆明種小鼠(50只)、SPF級(jí)離乳SD大鼠(108只)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102購(gòu)于上海保錄生物科技有限公司；中國(guó)倉(cāng)鼠肺(CHL)細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 鐵皮石斛葉(采自貴州省內(nèi)鐵皮石斛主產(chǎn)區(qū)，詳見(jiàn)表1)；2,4,7-三硝基-9-芴酮(TNF，批號(hào)：218031298，AccuStandard)；輔酶II(批號(hào)：410F022，Solarbio)；疊氮化鈉(NaN3，批號(hào)：MKBS2540V，Sigma-Aldrich)；絲裂霉素C(MMC，批號(hào)：LBP4042V，Sigma)；2-氨基芴(2-AF，批號(hào)：STBF2332V，Sigma-Aldrich)；MTT溶液(批號(hào)：20181210，Solarbio)；秋水仙素(批號(hào)：09754，Sigma)；1,8-二羥基蒽醌(Dan，批號(hào)：WXBC6772V，Sigma Aldrich)；環(huán)磷酰胺(CP，批號(hào)：17101825，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)；小牛血清(批號(hào)：20161021，浙江天杭生物科技股份有限公司)；MEM培養(yǎng)液(批號(hào)：8117272，gibco公司)；雙抗(批號(hào)：J170012，Hyclone)；甲醛、冰乙酸、2,4,6-三硝基酚、氫氧化鉀、甘油、水合氯醛、茜素紅等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 鐵皮石斛葉產(chǎn)地

1.3 儀器 LS-C0150 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；GHP-9270倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；1510酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)；AU480全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter)；M-series全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(Medonic)；ACL7000血凝分析儀(美國(guó)實(shí)驗(yàn)儀器公司)；H-500尿液分析儀(迪瑞)；YZ6H檢眼鏡(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)參考GB 15193.3-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》限量法[8]。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn)) 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)參考GB 15193.4-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》平板摻入法[9]。

2.2.2 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)參考GB 15193.5-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)》[10]。

2.2.3 體外哺乳細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 體外哺乳細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)參考GB 15193.23-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 體外哺乳類(lèi)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)》[11]。

2.3 90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn) 大鼠90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)參考GB 15193.13-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[12]。

2.4 致畸試驗(yàn) 大鼠致畸試驗(yàn)參考GB 15193.14-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 致畸試驗(yàn)》[13]。

2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 研究數(shù)據(jù)均采用Excel錄入，利用SPSS 16.0軟件開(kāi)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，方差齊者采用T檢驗(yàn)，若方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。其中，遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果中，染色體畸變率的比較使用卡方檢驗(yàn)，微核率的比較使用泊松分布法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 鐵皮石斛葉[劑量：10 g/(kg·bw)]經(jīng)口染毒后，兩周內(nèi)未見(jiàn)動(dòng)物死亡，亦無(wú)明顯的中毒癥狀或不良反應(yīng)，即樣品對(duì)雌、雄性SD大鼠的急性經(jīng)口LD50>10 g/(kg·bw)，判屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)別。詳見(jiàn)表2。

表2 鐵皮石斛葉對(duì)SD大鼠的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 遺傳毒性試驗(yàn)

3.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn)) 無(wú)論加與不加S9的試驗(yàn)，自發(fā)對(duì)照組的每皿平均回變菌落數(shù)均在正常值范圍內(nèi)，而陽(yáng)性對(duì)照組誘發(fā)的每皿平均回變菌落數(shù)均為自發(fā)對(duì)照組2倍以上，呈明顯陽(yáng)性反應(yīng)。鐵皮石斛葉各劑量組和溶劑對(duì)照組的平均回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)對(duì)照組的1倍，呈陰性反應(yīng)，即樣品無(wú)誘導(dǎo)試驗(yàn)菌株回復(fù)突變的作用。詳見(jiàn)表3和表4。

表3 鐵皮石斛葉細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果(第一次) (個(gè)/皿，

表4 鐵皮石斛葉細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果(第二次) (個(gè)/皿，

3.2.2 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 受試物各劑量組PCE/200比值與陰性對(duì)照組的差異均在20%以?xún)?nèi)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表示鐵皮石斛葉對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞增殖無(wú)不良影響。結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照組雌、雄動(dòng)物的微核率均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01)，受試物各組的微核率與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明鐵皮石斛葉在小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)中為陰性結(jié)果。詳見(jiàn)表5。

表5 鐵皮石斛葉對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響

3.2.3 體外哺乳細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 經(jīng)計(jì)算受試物對(duì)CHL細(xì)胞的IC50在-S9條件下為1.03 mg/mL，在+S9條件下為1.44 mg/mL。試驗(yàn)中加或不加S9時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞染色體畸變率均顯著高于陰性對(duì)照(P<0.05)，且畸變率均>10%，呈明顯陽(yáng)性反應(yīng)。各劑量組細(xì)胞染色體畸變率與陰性對(duì)照比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，且畸變率均<5%，表明鐵皮石斛葉在本實(shí)驗(yàn)條件下，未引起體外培養(yǎng)的CHL細(xì)胞染色體畸變。詳見(jiàn)表6。

表6 鐵皮石斛葉對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變率的影響

3.3 90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn) 大鼠90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)期間，對(duì)照組和3個(gè)劑量組動(dòng)物攝食、飲水、大小便正常，生長(zhǎng)發(fā)育情況表現(xiàn)良好，試驗(yàn)前后眼部檢查無(wú)異常，未觀察到明顯行為改變和中毒表現(xiàn)。大鼠體重、食物利用率、血液學(xué)、生化指標(biāo)、尿液指標(biāo)、臟器重量和臟體比等指標(biāo)未見(jiàn)損害性影響；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大體檢查及組織學(xué)檢查均未見(jiàn)由受試物引起的損害性改變。鐵皮石斛葉實(shí)際攝入的最大未觀察到有害作用劑量雄鼠為8.37 g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的112倍)，雌鼠為8.73 g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的116倍)。

3.4 致畸試驗(yàn) 鐵皮石斛葉經(jīng)口灌胃后各劑量組孕鼠均未見(jiàn)異常行為和中毒表現(xiàn)，各劑量組胎鼠體重、身長(zhǎng)和對(duì)照組比較, 其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組胎鼠均有胸骨缺失，未見(jiàn)胎鼠外觀畸形、內(nèi)臟畸形的發(fā)生，故認(rèn)為鐵皮石斛葉在最高劑量為人體推薦攝入量50倍[3.75 g/(kg·bw)]時(shí)，對(duì)母體無(wú)毒性作用，對(duì)胎鼠無(wú)致畸作用。

4 討論

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明鐵皮石斛葉對(duì)SD大鼠急性經(jīng)口LD50>10 g/kg·bw，判屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)別；鐵皮石斛葉的三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)(細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和體外哺乳細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn))結(jié)果均為陰性，無(wú)致突變作用；大鼠90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)提示在本試驗(yàn)條件下，設(shè)計(jì)最高劑量為人體推薦攝入量的100倍，實(shí)際攝入最高劑量雄鼠為112倍，雌鼠為116倍，鐵皮石斛葉未引起大鼠的整體健康狀況、生理生化功能和器官組織形態(tài)學(xué)等各項(xiàng)重要指標(biāo)的異常變化。鐵皮石斛葉實(shí)際攝入的最大未觀察到有害作用劑量雄鼠為8.37 g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的112倍)，雌鼠為8.73g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的116倍)；大鼠致畸試驗(yàn)證實(shí)最高劑量為人體推薦攝入量50倍[3.75 g/(kg·bw)]，鐵皮石斛葉對(duì)母體無(wú)毒性作用，對(duì)胎鼠無(wú)致畸作用。

隨著國(guó)家衛(wèi)生健康委、國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于對(duì)黨參等9種物質(zhì)開(kāi)展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)工作的通知》文件出臺(tái)，以及貴州省衛(wèi)生健康委關(guān)于《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 鐵皮石斛葉(干葉)》[14]發(fā)布實(shí)施，標(biāo)志著鐵皮石斛葉、鐵皮石斛可在一定范圍內(nèi)作為食品原料合法使用，今后，以鐵皮石斛葉、鐵皮石斛為原料的食品研發(fā)將迎來(lái)前所未有的機(jī)遇。