楊世英,賈斌鑫,康佳樂,魏 濤,劉峰娟,王 成

（1.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊830000；2.新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農產品質量安全重點實驗室，新疆 烏魯木齊830091；3.新疆農業(yè)科學院科研管理處，新疆 烏魯木齊830031）

我國是世界西瓜產量最多的國家，有著悠久的種植栽培歷史，新疆是我國西瓜主要的種植基地之一。據(jù)統(tǒng)計，2019年新疆西瓜的種植面積為4.717萬hm2左右，產量達到270.38萬t[1]。西瓜生長過程中病蟲害種類多、發(fā)生頻繁，因此需要噴施農藥來預防病蟲害的發(fā)生。在病蟲害綜合防治中，殺蟲劑、殺菌劑等化學農藥起到了無可替代的作用[2]，但這些化學物質的大量使用會對生態(tài)環(huán)境和食品安全造成諸多不利影響。自然界中廣泛存在多羥基化的甾醇類物質，Mitchell等[3]第一次從油菜花粉中分離出具有較高活性并且能使菜豆幼苗加速生長的物質，他們將這種物質命名為油菜素（Brassin）。Grove等[4]確定了該物質與甾醇內酯化學結構相同，便將該物質命名為油菜素內酯（Brassinolides，BRs）。由于油菜素內酯對植物的促進作用強，普遍被人們認為是第六大植物激素[5]。目前，油菜素內酯研究在果蔬農藥解毒方面取得了重大突破，其中24-表油菜素內酯（EBR）的應用較為常見。Sharma等[6]發(fā)現(xiàn)，芥菜經外源EBR噴施后，H2O2和O2含量明顯降低，同時超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化物酶（POD）等酶的活性顯著增強，并且大幅降低了芥菜幼苗中的農藥殘留量。殷燕玲等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，EBR噴施大蒜、韭菜能明顯改善農藥對植物體內的各種毒害作用。EBR對農藥脅迫有改善作用，可調節(jié)滲透調節(jié)物質如可溶性蛋白含量，激活植物的抗氧化防御系統(tǒng)[9]，促進農藥降解。目前，EBR處理對西瓜采后農藥殘留的降解和相關機理研究較少。團隊前期使用不同濃度的EBR處理西瓜，篩選出最佳處理濃度為0.5 mg/L。本試驗通過研究EBR處理對西瓜果實農藥殘留含量、解毒酶活性、活性氧代謝以及解毒物質的影響，探討EBR對西瓜果實農藥殘留降解機理，以期為EBR在西瓜中的應用提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

供試西瓜種子購自昌吉市金豐種植有限責任公司，種植于新疆農科院安寧渠試驗田。試驗挑選大小均勻、成熟度相同、無損傷、無病害的西瓜果實。

24-表油菜素內酯，北京索萊寶科技有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技中國有限公司；無水硫酸鎂，成都市科隆化學品有限公司；氯化鈉，天津市盛奧化學試劑有限公司；陶瓷均質子，河北藝心逸科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性生化檢測試劑盒、過氧化氫含量檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

DW-86W100醫(yī)用低溫保存箱（海爾），青島海爾特種電器有限公司；Thermo Fisher Scientific ST-16gR高速冷凍離心機，Thermo Electron Led Gmbh（德國）；Model XSE204分析天平，METTLER TOLEDO（瑞士）；XEVO-TQ液相色譜串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀，美國Waters公司；BSA223s型電子天平，美國賽多利斯公司；UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津公司；W5L-1水浴恒溫器，金壇市宏華儀器廠；Vortex-DS多用途渦旋混合儀，上海汗諾儀器有限公司；HH.S21-6電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備。

1.2 方法

1.2.1 田間處理及樣品采集

根據(jù)本團隊前期對西瓜中農藥殘留風險評估的結果，篩選出在西瓜中農藥使用頻率高、殘留含量較高、風險較大的4種農藥為啶蟲脒、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑。西瓜分別用1、0.5、0.1、0.01 mg/L的EBR處理后，噴施3.3 mL/L啶蟲脒、2.5 g/L多菌靈、2.5 g/L苯醚甲環(huán)唑、2.5 g/L腈菌唑，測定各處理組西瓜果實中4種農藥含量。結果發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/L EBR降解這4種農藥殘留的效果最好。因此，本試驗選取0.5 mg/L油菜素內酯噴施西瓜。

在西瓜成熟前24 d左右噴施EBR，以清水處理為對照，第2天噴施上述4種農藥，然后分別于噴藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、15 d、24 d進行樣品采集，2020年6—7月完成樣品采集工作。

1.2.2 樣品前處理方法

西瓜果實（全果）按照四分法切分，勻漿處理后稱取10 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（色譜純），渦旋1 min，搖床振蕩30 min，取出后向離心管中加入2 g NaCl和2 g無水硫酸鎂，再渦旋1 min，以10 000 r/min常溫離心3 min，取上清液10 mL加入到N-丙基乙二胺（PSA）管中，充分振蕩1 min，再以10 000 r/min常溫離心1 min，取上清液過0.22 μm濾膜并加入到進樣小瓶中，然后測定農藥殘留。剩余部分西瓜切成均勻的小塊，用錫紙包好后在液氮中浸泡，等待徹底凝固后置于-20℃下保存。

1.2.3 農藥殘留測定方法

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（ACQUITYUPLCBEH，50mm×2.1mm，1.7 μm，Waters公司）；柱溫：40℃；樣品室溫度：10℃；采用二元梯度洗脫分離，以甲醇（A）和1 mmol/L乙酸銨水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫，流速0.2 mL/min，進樣體積1 μL，運行15 min。梯度洗脫條件：0.0～1.0 min，5%A；1.0～2.0 min，5%～30%A；2～3 min，30%～45%A；3～7 min，45%～95%A；7～12 min，95%A；12～13 min，95%～5%A；13～15 min，5%A。

1.2.3.2 質譜條件

采用液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）電噴霧離子源，選擇反應監(jiān)測（SRM）電離源模式為電噴霧離子化（ESI），離子源極性為ESI＋；離子源溫度350℃；N2流量1.0 L/h；Ar流量0 mL/min；毛細血管電壓3.00 kV；脫溶劑溫度650℃；錐孔氣流量0 L/h；六級桿透鏡電壓0 V。各目標化合物質譜參數(shù)見表1。

表1 農藥的主要質譜參數(shù)Table 1 Main mass spectrum parameters of pesticides

1.2.4 酶活、代謝產物、活性氧代謝測定方法

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性，以及丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量、超氧陰離子（O2）產生速率、還原型谷胱甘肽含量的測定參照曹建康等[10]的方法。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、過氧化氫含量使用索萊寶試劑盒進行測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2018軟件錄入數(shù)據(jù)并作圖，應用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用鄧肯氏多重差異進行比較，當P＜0.05時，表示差異具有顯著性，當P＜0.01時，表示差異具有極顯著性。

2 結果與分析

2.1 EBR處理對西瓜果實中農殘含量的影響

由圖1A可知，西瓜噴施農藥后，EBR處理組除噴藥后5 d外，其余時間果實中啶蟲脒含量均低于對照組；噴藥后1、7、9 d，EBR處理組果實中啶蟲脒含量比對照組分別下降了83.33%、78.26%、74.58%，呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。噴藥后24 d，EBR處理組相比于對照組下降了51.80%。

由圖1B可知，噴藥后0、1、5、7 d，EBR處理組西瓜果實中多菌靈含量比對照組分別降低了85.29%、59.32%、40.74%、76.19%，顯著低于對照組（P＜0.05）。噴藥后3、9、15 d，EBR處理組果實中多菌靈含量與對照組之間差異不顯著。噴藥后24 d，EBR處理組果實中多菌靈含量比對照組下降了23.68%。

由圖1C可知，噴藥后0～5 d，EBR處理組果實中苯醚甲環(huán)唑含量顯著低于對照組（P＜0.05），5 d后，處理組與對照組果實中苯醚甲環(huán)唑含量差異不顯著。對照組除了噴藥后1、3、5 d，其余時間果實中苯醚甲環(huán)唑含量均在限量值以下。由此可見，在噴施農藥后5 d內噴施EBR組西瓜果實中苯醚甲環(huán)唑含量可有效降低。

由圖1D可見，噴藥后1、3、5、7 d，對照組果實中腈菌唑含量顯著高于EBR處理組（P＜0.05），分別為EBR處理組的9.23、1.55、2.46、10.02倍。9 d以后，對照組與EBR處理組果實中腈菌唑含量差異不顯著。由此可見，噴施EBR在一定程度上可以降低西瓜果實中腈菌唑的含量。

圖1 EBR處理對西瓜果實中4種農殘含量的影響Fig.1 Effects of EBR treatments on the contents of four agricultural residues in watermelon fruits

由圖2可以看出，在整個采樣期間，EBR處理組西瓜果實中農殘含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。EBR處理組與對照組均在噴藥后1 d達到最大值，分別為0.52、2.29 mg/kg。噴藥后5～24 d，兩組樣品中農殘含量的變化趨勢大致相同。噴藥后24 d，EBR處理組果實中農殘含量比對照組降低了24.44%。結果表明，EBR處理能有效降低西瓜果實中農藥殘留的含量。

圖2 EBR處理對西瓜果實中農殘含量的影響Fig.2 Effects of EBR treatments on pesticide residues contents in watermelon fruits

2.2 EBR處理對西瓜果實中活性氧代謝的影響

由圖3A可得，采樣周期內，EBR處理組果實的超氧陰離子產生速率均低于對照組（1 d和15 d除外）。噴藥0 d時，對照組超氧陰離子產生速率是EBR處理組的3.6倍，二者間差異達顯著水平（P＜0.05）。1～24 d，EBR處理組與對照組的超氧陰離子產生速率趨于穩(wěn)定。結果表明，噴施EBR能在一定程度上降低西瓜果實中超氧陰離子的產生速率。

由圖3B可得，在西瓜整個成熟期間，處理組果實中過氧化氫含量均高于對照組。噴藥后24 d，EBR處理組過氧化氫含量比對照組提高了6.4%。結果表明，EBR處理能夠在一定程度上提高西瓜果實中過氧化氫含量的積累。EBR可能將西瓜果實代謝產生的不穩(wěn)定的超氧陰離子轉化為更為穩(wěn)定的過氧化氫，從而避免了超氧陰離子對細胞的損害。

圖3 EBR處理對西瓜果實中活性氧代謝的影響Fig.3 Effects of EBR treatments on hydrogen peroxide metabolism in watermelon fruits

2.3 EBR處理對西瓜果實中解毒酶活性的影響

由圖4A所示，對于西瓜果實抗壞血酸過氧化物酶活性，0～5 d，EBR處理組與對照組之間無顯著性差異；7～24 d，EBR處理組迅速升高，顯著高于對照組（P＜0.05）；噴藥后24 d時，EBR處理組比對照組提高了435.58%，二者間呈顯著性差異（P＜0.05）。

由圖4B所示，EBR處理組西瓜果實的過氧化氫酶活性在整個采樣期間均顯著高于對照組果實（P＜0.05）。噴藥后24 d時，EBR處理組西瓜果實的過氧化氫酶活性達到最大值，是對照組果實酶活性的3.4倍，二者間呈顯著性差異（P＜0.05）。

由圖4C所示，在整個采樣期間EBR處理組西瓜果實的谷胱甘肽還原酶活性一直高于對照組，在噴藥后3、5、7、9、15 d采樣時，樣品的酶活性變化不明顯；但在0、1、24 d采樣時，EBR處理組西瓜果實的GR活性分別是對照組的2.94、1.83、2.44倍，顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖4 EBR處理對西瓜果實中解毒酶活性的影響Fig.4 Effects of EBR treatments on detoxification enzymes activities in watermelon fruits

由圖4D所示，西瓜噴施農藥后的整個采樣期間EBR處理組果實中苯丙氨酸解氨酶活性始終顯著高于對照組（P＜0.05），且處理組與對照組的變化趨勢相同。噴藥后0 d采樣時，EBR處理組果實中PAL活性是對照組的6.68倍。5 d采樣時，對照組果實的PAL活性比EBR處理組果實中酶低48.26%。24 d采樣時，EBR處理組PAL活性是對照組的5.35倍。

由圖4E所示，EBR處理組西瓜果實超氧化物歧化酶活性在整個采樣時期極顯著高于對照組（P＜0.01）。EBR處理組噴藥后1 d果實超氧化物歧化酶活性顯著提升，是對照組的1.79倍。1～5 d，EBR處理組果實的超氧化物歧化酶活性緩慢下降。5～24 d果實超氧化物歧化酶活性穩(wěn)定在1.3ΔOD560/（min·g），而對照組果實超氧化物歧化酶活性自始至終穩(wěn)定在0.8ΔOD560/（min·g）。

由圖4F所示，在整個采樣期間，EBR處理組果實過氧化物酶活性始終高于對照組。EBR處理組果實的過氧化物酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在噴藥后5 d達到最大值，顯著高于對照組（P＜0.05）。噴藥后24 d時，EBR處理組西瓜果實中過氧化物酶活性較對照提高了12.91%，顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.4 EBR處理對西瓜果實生理代謝的影響

還原型谷胱甘肽可與自由基等毒性物質結合形成機體更易代謝的物質，從而減少自由基的含量[11]。由圖5A可知，在整個采樣期間，噴施農藥后的EBR處理組西瓜果實中還原型谷胱甘肽含量與對照組相比顯著提高（P＜0.05）。噴藥后0～5 d的EBR處理組果實還原型谷胱甘肽含量迅速上升，且5d時的GSH含量為對照組的1.75倍，二者間呈顯著性差異（P＜0.05）。5～7 d，EBR處理組與對照組果實的還原型谷胱甘肽含量均急劇下降，7～9 d兩組又迅速上升。噴藥后24 d，EBR處理組GSH含量相比于對照組上升了17.5%，二者間差異顯著（P＜0.05）。

圖5 EBR處理對西瓜果實生理代謝的影響Fig.5 Effects of EBR treatments on physiological metabolism in watermelon fruits

丙二醛（MDA）的產生標志著細胞膜結構的損傷，其含量多少直接表明了膜損傷的程度，且MDA對細胞的損傷性能引起部分酶失活[12]。由圖5B可以看出，噴施農藥后整個采樣期間，對照組西瓜果實中MDA含量始終顯著高于EBR處理組（P＜0.05）。在整個采樣期間，EBR處理組MDA含量一直穩(wěn)定在0.8 μmol/g附近；而對照組果實中MDA含量在0～1 d迅速上升并達到最大值（1.44 μmol/g），顯著高于EBR處理組（P＜0.05）；1～24 d的對照組果實中MDA含量穩(wěn)定保持在1.3 μmol/g附近。

可溶性蛋白是眾多植物體內酶的重要組成成分[13]。由圖5C可見，EBR處理組西瓜果實中可溶性蛋白質含量與對照組的變化趨勢相同。噴施農藥后的0～3 d，EBR處理組與對照組相比，其可溶性蛋白質含量分別提高了45.45%、56.58%、16.64%，均顯著高于對照組（P＜0.05）；噴藥后的5～24 d，EBR處理組的可溶性蛋白質含量與對照組之間差異不大。

3 討論與結論

噴施EBR可以維持植物在逆境環(huán)境下體內的代謝平衡，通過提高可溶性蛋白等滲透調節(jié)物質的產生，進而提高過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶等部分解毒酶的活性，從而迅速清除細胞內多余的活性氧及自由基，使其達到平衡狀態(tài)，并一定程度上減少植物細胞膜與外界的流動性[14]。外源噴施EBR可以顯著提高半夏塊莖中可溶性蛋白含量和PAL活性[15]。葉片噴施不同濃度的EBR可使可溶性蛋白質和脯氨酸含量顯著升高，對穩(wěn)定細胞膜的結構具有積極作用[16]。番茄通過EBR處理，能使果實中可溶性蛋白含量顯著增加[17]。EBR處理有效抑制了辣椒果實中MDA含量的積累，減緩了總解毒能力的下降，較好地保持辣椒果實中解毒酶的活性，防止活性氧的過量積累對辣椒機體造成損害，保護細胞膜的完整性和功能性[18]。外源2,4-表油菜素內酯預處理能夠降低黃瓜葉片中H2O2和O2的積累，維持植物體內氧化還原平衡[19]。番茄提前噴施EBR，能使其在逆境環(huán)境中更加迅速地激活抗氧化酶系統(tǒng)來清除細胞所產生的H2O2和O2[20]。研究發(fā)現(xiàn)H2O2在活性氧代謝中對機體的毒害作用最小，可以以一種重要的信號分子來調節(jié)植物的生長發(fā)育過程[21]。EBR可顯著加速農藥殘留的降解，其機制可能與激發(fā)植物內在解毒機制有關。在實驗室相對封閉的環(huán)境下，油菜素內酯處理能顯著促進番茄、黃瓜、辣椒等作物中啶酰菌胺、毒死蜱、百菌清等農藥殘留的降解[22-24]。Zhou等[25]指出0.1 mmol·L-1EBR處理可使水稻、茶葉、西蘭花、草莓等植物上常見的有機磷、有機氯、氨基甲酸酯類農藥殘留量減少30%～70%；EBR能上調解毒關鍵酶的活性和解毒相關基因，并加快谷胱甘肽的更新，從而達到加速植物體內農藥殘留的降解代謝，進而降低植物體內農藥殘留量。同時，EBR能激活解毒系統(tǒng)，減少農藥引起的活性氧累積。植物通過體內存在的不同解毒酶和解毒物質來清除過氧化物質以維持體內平衡，GSH是農藥降解代謝中重要的中間物質，它能與農藥結合后將有毒化合物轉化為活性較低、水溶性較強的物質，從而參與農藥在植物細胞中的解毒過程[26]。外源EBR處理苜蓿幼苗后，其體內的解毒酶SOD、GPX、APX和GR等酶的活性顯著上升[27]。

試驗結果表明，EBR處理可保持西瓜果實中H2O2、可溶性蛋白、GSH含量，使果實中解毒酶（POD、SOD、CAT、GR、PAL、APX）活性維持在較高水平，顯著抑制O2的生成速率和MDA的積累，從而有效加速西瓜果實中啶蟲脒、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑的降解速率。BR處理對西瓜果實中不同農藥殘留的降解效果有一定的差別，但EBR總體上對西瓜果實農殘降解效果作用顯著，這說明EBR在農藥降解上具有靈活性。因此，為了提高西瓜的食用安全性，可以向其噴施適宜劑量的EBR，使得農藥殘留量大幅降低。