劉洋帆，李緒鵬，馮陽(yáng)，王迪，陳勝軍，楊賢慶，吳燕燕，鄧建朝*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300)3(廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 廣州，510300) 4(大連工業(yè)大學(xué)， 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連，116034)

鰹魚(yú)俗稱炸彈魚(yú)，分布于太平洋、印度洋、大西洋熱帶和亞熱帶海域，是金槍魚(yú)圍網(wǎng)漁業(yè)的主要目標(biāo)魚(yú)種[1]，也是世界上重要的海洋食物資源，占金槍魚(yú)產(chǎn)量的70%以上[2]。鰹魚(yú)魚(yú)肉的氨基酸種類豐富,易于人體吸收，且富含二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid，EPA)等多不飽和脂肪酸。深加工后的鰹魚(yú)味道鮮美,可制成柴魚(yú)、罐頭以及生魚(yú)片，便于消費(fèi)者食用，開(kāi)發(fā)前景比較樂(lè)觀[3]。

生物胺是一類含氮的低分子質(zhì)量有機(jī)化合物的總稱，常見(jiàn)的生物胺一共有8種，大概可以分成3種類型：脂肪族生物胺(精胺、亞精胺、尸胺、腐胺)，芳香族生物胺(苯乙胺、酪胺)和雜環(huán)胺(色胺、組胺)[4]。生物胺不僅是生成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)等的前體物質(zhì)，也是生成致癌物質(zhì)和亞硝基化合物的前體物質(zhì)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，生物胺存在于各種食品當(dāng)中，如水產(chǎn)品、肉類食品、發(fā)酵食品[6]等。食物中含有過(guò)量的生物胺，人體攝入后會(huì)產(chǎn)生不適，如頭痛、高血壓、發(fā)燒、皮疹、嘔吐等[7-8]。近年來(lái)，魚(yú)類食品因生物胺含量超標(biāo)而導(dǎo)致的中毒事件時(shí)有發(fā)生[9]，所以各個(gè)國(guó)家相繼規(guī)定了生物胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)規(guī)定水產(chǎn)品中組胺及酪胺最高限量分別為50 mg/kg和100 mg/kg[10]，新西蘭和澳大利亞規(guī)定水產(chǎn)品中組胺最大限量為200 mg/kg[11]，我國(guó)在GB 2733—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》中規(guī)定，青皮紅肉魚(yú)類組胺含量不超過(guò)400 mg/kg，其他水產(chǎn)品不超過(guò)200 mg/kg。上海市食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的DB31/2004—2012《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵肉制品》中規(guī)定組胺的含量不得超過(guò)100 mg/kg。

目前用于檢測(cè)生物胺的技術(shù)種類多樣，例如：高效液相色譜技術(shù)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)、離子色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、電化學(xué)生物傳感器技術(shù)等[12-14]。近幾年LC-MS逐漸應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域，該技術(shù)可以鑒別和測(cè)定各種類型的農(nóng)、獸藥及生物毒素等殘留物[15]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)技術(shù)較LC-MS技術(shù)分析時(shí)間更短、準(zhǔn)確度和靈敏度更高。UPLC-MS/MS在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)模式下具有很高的靈敏度，可以消除定量分析中基質(zhì)效應(yīng)的影響[16-17]，因此適用于復(fù)雜樣品的定量分析[18]。本研究?jī)?yōu)化了萃取試劑的種類及檢測(cè)條件，建立了基于UPLC-MS/MS法檢測(cè)8種生物胺的方法，并考察了其在鰹魚(yú)樣品中生物胺檢測(cè)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)品(組胺、尸胺、腐胺、酪胺、色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺和1，7-二氨基庚烷，純度≥98%)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇(質(zhì)譜純)，美國(guó)Thermon Fisher公司；乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)、二氯甲烷，麥克林生化科技公司；0.22 μm一次性針頭過(guò)濾器，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PRiME HLB 固相萃取柱(100 mg)、C18固相萃取柱(100 mg)，美國(guó)Waters公司；N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)吸附劑、石墨化碳黑(graphitized carbon black，GCB)吸附劑，CNW科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用鰹魚(yú)均來(lái)自廣東省沿海城市漁市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ-S Micro超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；TDZ5-WS離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；JJ324BF型電子天平，雙杰測(cè)試儀器廠；CEBO-24高通量組織研磨儀，上海測(cè)博生物有限公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；氮吹儀，力辰科技有限公司；IKA T50均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量2 μL，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相A：0.5%的甲酸水，流動(dòng)相B：甲醇。流動(dòng)相洗脫梯度(A相)：0.0～1.5 min，95%；1.5～2.0 min，95%～55%；2.0～3.0 min，55%～2%；3.0～6.0 min，2%～95%。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，電噴霧正離子(electrospray ionization, ESI+)模式；干燥氣溫度：400 ℃；干燥氣體流量：1 000 L/h；毛細(xì)管電壓：3 000 V；錐孔氣體流量：50 L/h；掃描模式：MRM；9種目標(biāo)化合物的MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 MRM模式下9種生物胺的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 9 biogenic amines in MRM mode

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品(組胺、尸胺、腐胺、酪胺、色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺)，每種標(biāo)準(zhǔn)品稱取0.01 g，將8種標(biāo)準(zhǔn)品混合放入10 mL的容量瓶中，用超純水溶解標(biāo)準(zhǔn)品并定容到10 mL，配制成1 000 mg/L 的混合標(biāo)液，置于-20 ℃冰箱中貯藏。將內(nèi)標(biāo)物1，7-二氨基庚烷用超純水稀釋成1 000 mg/L，放于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。混合標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)液根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求的濃度現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 樣品前處理

1.3.4.1 提取

50 mL的離心管中放入2顆鋼珠和2 g攪碎的魚(yú)肉，加入5 mL的0.2%酸化乙腈溶液和100 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的內(nèi)標(biāo)液，置于高通量組織研磨儀提取10 min，取出后以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液于試管中。重復(fù)以上操作，將2次上清液合并后進(jìn)行氮吹。

1.3.4.2 提取液的選擇

提取溶劑的選擇，一方面影響分析方法的回收率，另一方面有助于較少基體的影響。相關(guān)文獻(xiàn)一般采用鹽酸、高氯酸、三氯乙酸、乙腈或乙酸乙酯等溶劑為提取劑，考慮到強(qiáng)酸溶液如果沒(méi)有完全凈化，進(jìn)入質(zhì)譜會(huì)腐蝕儀器，將含有強(qiáng)酸的提取液去除掉。葉磊海等[19]對(duì)比了乙腈、0.2%酸化乙腈、乙腈混合乙酸乙酯體積比(1∶1)的提取效果，發(fā)現(xiàn)0.2%酸化乙腈有更好沉淀蛋白的效果。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比同一樣品分別用0.2%酸化乙腈和0.2%酸化甲醇提取生物胺的結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2%酸化乙腈整體效果更好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇0.2%酸化乙腈作為樣品的提取液。

1.3.4.3 凈化

將吹至盡干的樣品用1 mL的流動(dòng)相進(jìn)行復(fù)溶，加入3 mL的二氯甲烷，渦旋1 min后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm的濾膜，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

固相萃取凈化：C18固相萃取柱，甲醇活化小柱，加入2 mL提取液，用2 mL的40%甲醇溶液將生物胺洗脫下來(lái)，收集洗脫液，過(guò)濾后上機(jī)。PRiME HLB固相萃取柱，直接將2 mL提取液過(guò)柱，收集過(guò)濾后上機(jī)。PAS和GCB為填料，分別稱取100 mg的填料物質(zhì)于10 mL離心管，加入2 mL提取液，渦旋1 min，放入離心機(jī)以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后取上清液，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖譜采集及原始數(shù)據(jù)處理用Waters MassLynx軟件完成，采用Excel 2019軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用IBM SPSS Statistics 25軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果

根據(jù)母離子和子離子的參考值，使用質(zhì)譜調(diào)諧，優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)。用建立好的UPLC-MS/MS方法檢測(cè)質(zhì)量濃度為10 mg/L的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)液，由圖1看出8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品在MRM模式下的峰形良好，不同離子通道可將8種生物胺分開(kāi)進(jìn)行分析。

a-精胺; b-色胺; c-亞精胺; d-酪胺; e-β-苯乙胺; f-組胺; g-尸胺; h-腐胺圖1 八種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析圖Fig.1 Chromatographic analysis chart of 8 kinds of biogenic amines standards

2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

4種前處理的結(jié)果，如圖2所示。鑒于樣品提取液中含有大量蛋白和脂肪，凈化的目的是除去提取液中的蛋白質(zhì)、脂肪等多種雜質(zhì)，本文選擇使用C18固相萃取柱、PRiME HLB固相萃取柱、PSA填料和GCB填料4種凈化材料以及二氯甲烷對(duì)樣品進(jìn)行前處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GCB填料可以吸附內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，造成數(shù)據(jù)分析的誤差，所以GCB填料的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不放入對(duì)比圖。前處理使用PRiME HLB固相萃取柱和PSA填料的回收率相對(duì)較低，前處理使用二氯甲烷和C18固相萃取柱的回收率相對(duì)較好，2種方法的回收率分別為109%和86%。C18固相萃取柱對(duì)脂類、色素、芳香族化學(xué)成分有明顯的吸附作用[20]，對(duì)生物胺也有一定的吸附作用。通過(guò)比較，無(wú)論是實(shí)際凈化步驟的復(fù)雜程度，還是保留效果和回收率，二氯甲烷凈化效果優(yōu)于其他4種萃取柱和填料。鰹魚(yú)體內(nèi)脂肪含量低，含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)最高可達(dá)26.1%[21]。乙腈提取液可以沉淀樣品中大部分的蛋白質(zhì)，在復(fù)溶后的樣品中加入二氯甲烷，可以有效地除去蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)。

圖2 四種不同前處理方法的組胺回收率對(duì)比圖Fig.2 Comparison chart of histamine recovery rates of 4 different pretreatment methods

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 檢出限、定量限、精密度和標(biāo)準(zhǔn)曲線

基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜檢測(cè)中普遍存在，在動(dòng)物源性食品中的檢測(cè)更為明顯[22]，本試驗(yàn)使用鰹魚(yú)的基質(zhì)樣品溶液作為底液，添加少量不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)8種生物胺建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定檢出限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantitation，LOQ)，以此來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。按照1.3.4的步驟提取基質(zhì)樣品溶液，800 μL基質(zhì)樣品溶液中加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液和100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混合均勻后過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)前期檢測(cè)結(jié)果可知，在低濃度時(shí)精胺和亞精胺的響應(yīng)值較其他6種生物胺低，需適當(dāng)提高這2種生物胺的線性范圍，精胺和亞精胺的線性范圍是1～20 mg/L，色胺、酪胺、β-苯乙胺、組胺、尸胺和腐胺的線性范圍是0.5～10 mg/L。

8種生物胺在基質(zhì)樣品溶液中的檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如表2所示，8種生物胺的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R在0.995 6～0.999 6，說(shuō)明生物胺在基質(zhì)樣品溶液中線性關(guān)系良好，以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)作為L(zhǎng)OD和LOQ，計(jì)算出相應(yīng)方法的檢出限和定量限，8種生物胺的LOD為75～150 μg/kg，LOQ為250～500 μg/kg。連續(xù)對(duì)2 mg/L 的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣6次，分析平行結(jié)果，8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值為1.2%～6.5%，說(shuō)明UPLC-MS/MS儀器的精密度良好。

表2 八種生物胺在基質(zhì)樣品溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限Table 2 Standard curve, LOD and LOQ of 8 biogenic amines in matrix sample solution

2.3.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)

將生物胺標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行稀釋，隨后分別取100 μL加入2 g樣品中,按照建立好UPLC-MS/MS方法檢測(cè)加標(biāo)樣品生物胺含量，做6組平行試驗(yàn)，計(jì)算3個(gè)加標(biāo)水平的回收率和RSD，結(jié)果如表3所示。8種生物胺的平均加標(biāo)回收率為82%～113%，RSD為2.3%～9.7%。

表3 八種生物胺的加標(biāo)回收結(jié)果Table 3 Standard addition recovery results of 8 biogenic amines

2.4 樣品的結(jié)果分析

取同一條新鮮鰹魚(yú)的赤身(背中部)部位，25 ℃條件下貯藏，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔12 h檢測(cè)樣品中生物胺的含量，觀察樣品3 d內(nèi)生物胺含量的變化。在72 h的貯藏時(shí)間內(nèi)，酪胺、組胺、β-苯乙胺、腐胺和尸胺有一定變化，精胺、亞精胺和色胺變化不明顯。酪胺、組胺、β-苯乙胺、腐胺和尸胺5種生物胺的含量變化如圖3所示，由圖3可知,在25 ℃存放條件下，組胺變化最為明顯，從12～24 h，組胺含量從302.1 mg/kg迅速上升到668.1 mg/kg，明顯超過(guò)我國(guó)所規(guī)定的最大限。在25 ℃ 存放12 h后檢測(cè)出酪胺的含量為44.1 mg/kg，到72 h其含量上升到168.6 mg/kg，苯乙胺存放24 h后開(kāi)始檢測(cè)出，從6.0 mg/kg上升到13.3 mg/kg，腐胺在貯藏24 h后檢測(cè)出，從16.0 mg/kg上升到80.8 mg/kg，尸胺的含量在貯藏結(jié)束時(shí)達(dá)到351.2 mg/kg。

8種生物胺中組胺和酪胺的毒性最大[23]，腐胺、尸胺還可通過(guò)抑制生物胺分解酶的活性，可增加組胺和酪胺的含量和毒性[24]，應(yīng)嚴(yán)格控制這4種生物胺的在水產(chǎn)品中的含量。水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)與微生物有著密切聯(lián)系，其體內(nèi)的氨基酸與體外游離的氨基酸被氨基酸脫羧酶作用生成生物胺，這些酶由產(chǎn)胺菌生成，所以生物胺與水產(chǎn)品的新鮮度有內(nèi)在關(guān)聯(lián)[25]。研究結(jié)果表明，鰹魚(yú)作為紅肉魚(yú)類，貯藏不當(dāng)情況下，很容易造成組胺超標(biāo)現(xiàn)象，食品企業(yè)多用鰹魚(yú)加工成罐頭制品，為了保障產(chǎn)品安全，加工之前有必要檢測(cè)鰹魚(yú)中生物胺的含量。

圖3 在25 ℃貯藏條件下酪胺、苯乙胺、腐胺、組胺和尸胺的 含量變化Fig.3 Changes in the content of tyramine, β-phenylethylamine, putrescine, histamine and cadaverine under storage conditions of 25 ℃

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)檢測(cè)8種生物胺的UPLC-MS/MS方法，用C18色譜柱進(jìn)行分離，在正離子MRM模式下進(jìn)行分析，6 min內(nèi)可以分析出8種生物胺的檢測(cè)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)系數(shù)R值在0.995 6～0.999 6，該方法的LOD為75～150 μg/kg，LOQ為250～500 μg/kg。在加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中(n=6)，樣品的平均回收率在82%～113%，RSD在2.3%～9.7%。用建立好的UPLC-MS/MS方法檢測(cè)鰹魚(yú)樣品，樣品在25 ℃貯藏72 h后，組胺含量達(dá)到668.1 mg/kg，酪胺含量達(dá)到168.6 mg/kg，腐胺含量達(dá)到80.8 mg/kg，尸胺含量達(dá)到351.2 mg/kg，說(shuō)明鰹魚(yú)腐敗變質(zhì)程度和生物胺的含量呈正相關(guān)。本方法分析時(shí)間短，在6 min內(nèi)可以檢測(cè)出樣品中生物胺含量，且樣品前處理無(wú)需衍生化處理，可對(duì)檢測(cè)生物胺進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性和定量，操作簡(jiǎn)單、回收率良好大大提高了樣品檢測(cè)效率。