楊婷婷，孫萬(wàn)成，羅毅皓*，馮聲寶

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016)2(青?；ブ煊拥虑囡乒煞萦邢薰?，青海 西寧，810016)

每年青稞酒制造廠會(huì)產(chǎn)生大量酒糟，青稞酒糟(highland barley fermentation spent，HBFS)的蛋白質(zhì)質(zhì)量較高，研究青稞酒糟中的蛋白質(zhì)是實(shí)現(xiàn)青稞酒糟合理化利用的基礎(chǔ)，同時(shí)能有效緩解環(huán)境污染，減少酒糟的丟棄浪費(fèi)，節(jié)約大量資源。

青稞酒糟粗蛋白是制備青稞酒糟多肽[1]的主要原料，干酒糟中含有大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的含量為14.3%～21.8%[2]。目前酒糟中蛋白質(zhì)的提取方法主要有醇?jí)A法[3]、堿法[4]和酶法[5]。醇?jí)A法、堿法主要是利用堿提酸沉的原理，將酒糟蛋白溶解到稀堿溶液中，再將溶液pH降低至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，使酒糟蛋白沉淀析出；而酶法則是利用酶破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，通過(guò)提高蛋白質(zhì)在提取溶劑中的溶解度，提高粗蛋白的得率。

有學(xué)者[6]通過(guò)從咖啡殘?jiān)l(fā)酵物中提取蛋白，再通過(guò)胃蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行消化得到水解肽，這實(shí)驗(yàn)充分表明酒糟中也含有一定的多肽；國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)多肽類(lèi)物質(zhì)具有一定抗氧化作用[7]，也能治療由酒精引起的炎癥[8]，從啤酒麥糟(brewers′ spent grain，BSG)中提取出具有良好抗氧化性的酚酸，能有效進(jìn)行高血壓管理[9]，同時(shí)也有學(xué)者通過(guò)對(duì)蒸餾廢谷物(distiller′s spent grain，DSG)的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的谷物蛋白質(zhì)對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)[10]、葡萄糖和淀粉酶活性[11]具有抑制作用。這些也為青稞酒糟多肽的研究提供了參考。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于青稞酒糟多肽的提取工藝及其功能性研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在為進(jìn)一步利用HBFS提供理論參考，使HBFS各組分得到合理的資源化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HBFS，青海西寧天佑德青稞酒廠；堿性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(120 U/mg)、動(dòng)物蛋白酶(100 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(20 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)，源葉生物；牛血清蛋白V，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ESJ110-413電子分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；DGX-9073B電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；G555-9真空冷凍干燥機(jī)，基因有限公司；H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī)、LR-10M高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；HJ-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器，崢嶸儀器；pHS-3C精密pH計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；AKTApure 25M蛋白層析系統(tǒng)，江蘇漢邦科技有限公司；UV-1780雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，蘇州島津儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青稞酒糟蛋白質(zhì)的提取[12]

(1)醇?jí)A法：取一定量新鮮酒糟粉末，加入醇?jí)A混合液[V(95%乙醇)∶V(0.5 mol/L NaOH)=1∶2]，固液比1∶40，攪拌240 min。離心后取上清液，使用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至4.7，靜置沉淀后離心，得到粗蛋白沉淀，加水調(diào)節(jié)至中性，取濾液，放入離心機(jī)離心，得到粗蛋白沉淀，冷凍干燥。

(2)堿法：取一定量新鮮酒糟粉末，加入0.5 mol/L NaOH，固液比1∶35，攪拌240 min。離心后取上清液，使用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至5.2，靜置沉淀。放入離心機(jī)離心，得到粗蛋白沉淀，加水調(diào)節(jié)至中性，取濾液，放入離心機(jī)離心，得到粗蛋白沉淀，冷凍干燥。

(3)酸法：取一定量新鮮酒糟粉末，加入鹽酸、乙醇溶液、0.25%亞硫酸鈉，固液比1∶10(g∶mL)，攪拌240 min。離心后取上清液，真空減壓濃縮，靜置沉淀。放入離心機(jī)離心，得到粗蛋白沉淀，加水洗滌，取濾液，放入離心機(jī)離心，得到蛋白沉淀，冷凍干燥。

1.3.2 青稞酒糟蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，取2 mg青稞酒糟蛋白粉溶于10 mL蒸餾水中，得到200 μg/mL的蛋白溶液，吸取1 mL蛋白溶液，加入5 mL福林酚試劑甲混勻，于20～25 ℃保溫10 min，再吸取0.5 mL福林酚，立即搖勻，于20～25 ℃保溫20 min，然后于500 nm處比色。以1 mL蒸餾水代替蛋白溶液做空白參照。

1.3.3 青稞酒糟蛋白定性定量分析

向蛋白溶液中加入2%脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDC)溶液，95 ℃煮10 min，超聲探頭超聲10 min對(duì)蛋白進(jìn)行變性。按50∶1加入Trypsin胰蛋白酶，37 ℃孵育振蕩過(guò)夜酶切。加入三氯乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)終止酶切，調(diào)節(jié)溶液pH值在6.0左右，12 000×g離心15 min，使用SDB小柱進(jìn)行除鹽。除鹽后的肽段溶液經(jīng)離心濃縮儀抽干后，凍存于-20 ℃等待上機(jī)檢測(cè)。

使用Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析。利用納升流速的液相UltiMate 3000 RSLCnano系統(tǒng)分離樣品。肽段樣品經(jīng)過(guò)上樣緩沖液溶解，由自動(dòng)進(jìn)樣器吸入后結(jié)合至C18捕獲柱(3 μm，120 ?，100 μm×20 mm)，接著被洗脫至分析柱(2 μm，120 ?，75 μm×150 mm)進(jìn)行分離。利用2個(gè)流動(dòng)相(流動(dòng)相A：3%二甲基亞砜和0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：3%二甲基亞砜和0.1%甲酸乙腈溶液)建立分析梯度。液相的流速設(shè)置為300 mL/min。質(zhì)譜DDA模式分析時(shí)，每個(gè)掃描循環(huán)中包含1個(gè)MS全掃描(R=70 K，AGC=3e6，max IT=20 ms，掃描范圍=350～1 800m/z)，以及隨后的15個(gè)MS/MS掃描(R=17.5 K，AGC=2e5，max IT=100 ms)。HCD碰撞能量設(shè)置為28。四級(jí)桿的篩選窗口設(shè)置為1.6 Da。離子重復(fù)采集的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為35 s。

1.3.4 青稞酒糟蛋白質(zhì)的純化[13]

采用AKTA pure蛋白核酸純化儀和5 mL的HiTrap DEAE FF離子交換層析柱進(jìn)行蛋白純化，整個(gè)純化過(guò)程流速控制在2 mL/min。取3 mg不同方法提取的青稞酒糟蛋白粉溶于10 mL PBS緩沖液中，放入離心機(jī)離心后，取上清液。純化過(guò)程如下：

(1)柱平衡及上樣。用5個(gè)柱體積的PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.0)平衡離子交換柱，以5 mL/min的流速將青稞酒糟粗蛋白泵入。

(2)清洗雜質(zhì)蛋白。用5個(gè)柱體積的PBS緩沖液充分沖洗，除去未結(jié)合蛋白。

(3)梯度洗脫。設(shè)置30%、50%和80% 3種梯度依次洗脫20個(gè)柱體積，洗下目標(biāo)蛋白并進(jìn)行收集。

(4)泵洗及卸層析柱。用2 mol/L NaCl將未完全洗脫的蛋白質(zhì)沖洗下來(lái)。

1.3.5 青稞酒糟多肽的制備

酶解前水洗除雜：取10 g青稞酒糟蛋白粉，按1∶6(g∶mL)的比例加水，在60 ℃的水浴鍋中恒溫振蕩30 min后，離心。

酶解[14]：取1 g青稞酒糟蛋白，加入30 mL蒸餾水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，添加適量酶，水解240 min，于90 ℃水浴鍋中滅活15 min，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液，凍干。不同種類(lèi)蛋白酶酶解條件如表1所示。

表1 不同蛋白酶最適pH值、溫度及酶活力Table 1 The optimum pH,temperature and enzyme activity of different proteases

1.3.6 青稞酒糟多肽水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法[15]測(cè)定。

1.3.7 青稞酒糟多肽對(duì)乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)的激活效果

參考王培宇[16]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8 青稞酒糟多肽的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.8.1 對(duì)DPPH自由基的清除效果

參考曹磊等[17]的實(shí)驗(yàn)方法稍作修改，進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8.2 對(duì)羥自由基(·OH)的清除效果

參考郭輝等[18]的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行檢測(cè)。

參考馬吉瑤等[19]的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用IBM SPSS statistics 24軟件中的方差分析法進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著，繪圖軟件選用OriginPro軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞酒糟蛋白質(zhì)的提取

以牛血清蛋白為標(biāo)品，得到線性方程y=0.001 4x+0.007 2，R2=0.991 9，線性關(guān)系良好，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算蛋白含量。

由圖1可知，通過(guò)醇?jí)A法提取HBFS中的蛋白得率高于堿法和酸法，其中醇?jí)A法得率是酸法的2倍左右。結(jié)果與侯夢(mèng)媛[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)果(7.091%，純度95.20%)大體一致，但也存在略微差異，主要原因應(yīng)該是酸法提取時(shí)加入大量強(qiáng)酸溶液，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解，使蛋白質(zhì)得率降低。周紅等[21]研究表明，不同品種青稞中粗蛋白含量平均值為13.32%，變幅為12.19%～14.07%，其中Z523青稞蛋白質(zhì)含量最高為14.07%；李倩[22]研究表明，青稞酒糟蛋白中粗蛋白含量為23.57%，經(jīng)過(guò)對(duì)比說(shuō)明青稞在釀造過(guò)程中，蛋白質(zhì)含量升高，這與侯夢(mèng)媛[20]的研究結(jié)果相符，酒糟在釀造過(guò)程中四大種類(lèi)蛋白質(zhì)清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和球蛋白的含量均呈上升趨勢(shì)。

圖1 不同提取方法對(duì)青稞酒糟蛋白得率的影響Fig.1 Effect on different extraction methods on protein yield注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(下同)

2.2 青稞酒糟多肽的制備

2.2.1 不同種類(lèi)酶對(duì)青稞酒糟蛋白質(zhì)的酶解影響

由表2可知，在各個(gè)酶最適條件下，堿性蛋白酶水解液的水解度最高，達(dá)到10.61%，這與其他文獻(xiàn)所述內(nèi)容是一致的。不同種類(lèi)酶對(duì)青稞酒糟蛋白的酶解結(jié)果差異較大，主要考慮是酶解使用的青稞酒糟蛋白是醇?jí)A法提取的，而堿性蛋白酶的最適作用條件是堿性環(huán)境，更有利于堿性蛋白酶作用于酶切位點(diǎn)，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸終端[23]。因此堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物水解程度更高。

表2 不同種類(lèi)酶對(duì)青稞酒糟蛋白的酶解效果Table 2 The enzymatic hydrolysis effect of different kinds of enzymes

2.2.2 青稞酒糟多肽對(duì)ADH的激活影響

由圖2可知，青稞酒糟多肽具有較強(qiáng)的ADH激活率，這充分表明青稞酒糟多肽有助于穩(wěn)定的產(chǎn)生NAD+，從而抑制血醇濃度升高，具有較好的醒酒效果。同時(shí)由圖2中可以看出堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的醒酒活性優(yōu)于其他種類(lèi)水解酶，原因可能是這兩類(lèi)蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度更高，酶解產(chǎn)物中含有更多低分子質(zhì)量多肽。與郭輝等[18]相對(duì)分子質(zhì)量小的多肽對(duì)ADH起主要的激活效果的結(jié)論相符。李萌[24]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證綠豆多肽對(duì)ADH活性的影響，當(dāng)綠豆多肽質(zhì)量濃度為0.8 g/mL時(shí)，對(duì)ADH活性激活效果明顯，尤其是分子質(zhì)量為5 000 Da的綠豆多肽對(duì)ADH的激活效果優(yōu)于高分子質(zhì)量綠豆多肽。寧慶鵬[25]研究表明，花生粕多肽酶解濃度為81.78%時(shí)，對(duì)ADH的激活率20.14%，當(dāng)花生粕多肽的分子質(zhì)量在1 000～3 000 Da時(shí)，具有最優(yōu)的激活效果，低分子質(zhì)量多肽是激活A(yù)DH的最有效成分。

圖2 不同種類(lèi)蛋白酶酶解的青稞酒糟多肽對(duì)ADH的激活效果Fig.2 Activation effect of polypeptides hydrolyzed by different kinds of proteases on ADH

2.3 青稞酒糟蛋白定性定量分析

對(duì)比圖3-a、3-b、3-c中峰值出現(xiàn)的位置均是在50%梯度洗脫時(shí)，這表明3種不同方法提取的主要蛋白種類(lèi)相同，而三者峰值出現(xiàn)時(shí)間不同，可以考慮為3種提取方法得到的蛋白溶液pH存在差異，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與DEAE離子交換層析柱的結(jié)合力不同，其中醇?jí)A法中蛋白與DEAE層析柱間結(jié)合力強(qiáng)于酸法和堿法提取的蛋白，因此醇?jí)A法峰值出現(xiàn)最晚。

a-純化醇?jí)A法提取的青稞酒糟蛋白；b-純化堿法提取的青稞酒糟蛋白；c-純化酸法提取的青稞酒糟蛋白圖3 純化不同方法提取的青稞酒糟蛋白Fig.3 Purification of barley lees protein extracted by different methods

同時(shí)由圖4可以看出，通過(guò)AKTA pure蛋白純化儀純化后的青稞酒糟蛋白的純度得到明顯的提升，純化后的酒糟蛋白純度遠(yuǎn)優(yōu)于純化前。

圖4 純化前后青稞酒糟蛋白的純度對(duì)比Fig.4 Comparison of protein purity before and after purification

對(duì)純化后蛋白樣品經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，共鑒定到29個(gè)蛋白的38個(gè)肽段，其中29個(gè)蛋白獲得準(zhǔn)確定量信息。通過(guò)比較醇?jí)A法和堿法2種不同方法提取的蛋白質(zhì)，篩選出11種差異蛋白，將各個(gè)樣本的相對(duì)定量值取對(duì)數(shù)(log2x)，使其符合正態(tài)分布，結(jié)果如圖5所示。

圖5 蛋白定量信息總覽Fig.5 Overview of protein quantification information

由表3可知，物質(zhì)運(yùn)輸、代謝途徑、生物合成、生物調(diào)節(jié)等是11種差異蛋白比較集中的15個(gè)生物學(xué)途徑。其中物質(zhì)運(yùn)輸、代謝途徑、生物合成和生物調(diào)節(jié)類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)量較多，分別占所有差異蛋白的10.34%、10.34%和6.90%。根據(jù)GO功能富集分析顯示，青稞酒糟蛋白在有機(jī)物代謝、NADH再生、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)移酶活性、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、RNA加工和翻譯后修飾、囊泡運(yùn)輸(圖6-a)方面最為豐富。具有胞內(nèi)細(xì)胞器(intracellular organelle)、核糖核蛋白復(fù)合物(ribonucleoprotein complex)、催化絡(luò)合物(catalytic complex)等是差異蛋白主要的10種細(xì)胞組分，其中胞內(nèi)細(xì)胞器、核糖核蛋白復(fù)合物和催化絡(luò)合物分別占51.43%、11.43%和8.57%(圖6-b)。富集到有機(jī)環(huán)化合物(organic cyclic compound binding)、離子結(jié)合(lon binding)、染色質(zhì)結(jié)合(chromatin binding)、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activity)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(transciption regulator activity)5種主要執(zhí)行的分子功能(圖6-c)，其中有機(jī)環(huán)化合物占42.86%，離子結(jié)合占21.43%，染色質(zhì)結(jié)合占14.29%，超氧化物歧化酶活性14.29%，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子占7.14%。圖7為最顯著的15條代謝通路分析結(jié)果，顯示差異基因主要與微生物代謝、過(guò)氧化物酶體、氧化磷酸化和次生代謝物的生物合成有關(guān)。

表3 差異蛋白Table 3 Differential proteins

a-青稞酒糟蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程；b-青稞酒糟蛋白所處的細(xì)胞組分；c-青稞酒糟蛋白執(zhí)行的分子功能圖6 GO注釋Fig.6 GO annotation

圖7 KEGG通路分析Fig.7 KEGG pathway analysis

2.4 青稞酒糟多肽的體外抗氧化試驗(yàn)

2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除效果

由圖8可知，青稞酒糟多肽對(duì)DPPH自由基有良好的清除效果，同時(shí)青稞酒糟多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果隨濃度增大逐漸增強(qiáng)，在青稞酒糟多肽質(zhì)量濃度為21 μg/L處趨于穩(wěn)定，此時(shí)青稞酒糟多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果達(dá)(70.76±1.35)%。這說(shuō)明DPPH自由基中的不成對(duì)電子數(shù)量減少，導(dǎo)致溶液在517 nm處的吸光值降低，猜測(cè)可能是青稞酒糟多肽能捕捉DPPH自由基中的單電子，但青稞酒糟多肽對(duì)DPPH自由基具體的清除機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

圖8 不同濃度青稞酒糟多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.8 DPPH scavenging effects of peptides at different concentrations

2.4.2 對(duì)·OH的清除效果

由圖9可知，青稞酒糟多肽對(duì)·OH有一定的清除效果，當(dāng)青稞酒糟多肽質(zhì)量濃度為21 μg/L時(shí)，青稞酒糟多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果達(dá)(52.05±2.09)%，說(shuō)明青稞酒糟多肽可以通過(guò)減少·OH的生成量，減少于510 nm處有特殊吸光度的2,3-二羥基苯甲酸的生成，同時(shí)青稞酒糟多肽對(duì)·OH的清除效果隨濃度變化較小，可能是清除效果受到多肽溶液中較多鹽離子以及其他雜質(zhì)的影響。

圖9 不同濃度青稞酒糟多肽對(duì)·OH的清除效果Fig.9 ·OH scavenging effects of peptides at different concentrations

圖10 不同濃度青稞酒糟多肽對(duì)的清除效果 scavenging effects of peptides at different concentrations

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明醇?jí)A法提取青稞酒糟蛋白的得率和純度高于其他2種方法，醇?jí)A法提取青稞酒糟蛋白的得率為(7.52±0.12)%，純度為(46.64±0.37)%，因此可以看出，不同的提取方法會(huì)影響蛋白質(zhì)得率和純度，醇?jí)A法更適合青稞酒糟蛋白的提取。

利用AKTA pure蛋白純化儀對(duì)青稞酒糟蛋白進(jìn)行蛋白純化，再利用Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)青稞酒糟蛋白進(jìn)行定性和定量分析。最后檢索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，其中共有29個(gè)蛋白獲得準(zhǔn)確定量信息，共檢索出11種差異蛋白，再基于GO注釋和KEGG富集分析，得出物質(zhì)運(yùn)輸、代謝途徑、生物合成、生物調(diào)節(jié)等是11種差異蛋白質(zhì)比較集中的15個(gè)生物學(xué)途徑，5種細(xì)胞組分以及5種分子功能，其中與物質(zhì)運(yùn)輸、代謝途徑、生物合成和生物調(diào)節(jié)類(lèi)有關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)量較多，分別占所有差異蛋白的10.34%、10.34%和6.90%。GO功能富集分析顯示，差異蛋白基因主要富集在有機(jī)物代謝、NADH再生、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)移酶活性、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、RNA加工和翻譯后修飾、囊泡運(yùn)輸。參與RNA加工和翻譯后修飾的P28003、P50138蛋白在富集分析中表現(xiàn)出最低的p值，差異蛋白主要與微生物代謝、過(guò)氧化物酶體、氧化磷酸化、次生代謝物的生物合成有關(guān)，不同的提取方法顯著改變了差異基因在過(guò)氧化物酶體、氧化磷酸化方面的代謝通路。