孫麗君，劉建學(xué),2,3*，韓四海,2,3，李佩艷,2,3，郭金英,2,3，羅登林,2,3

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)2(河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽，471023) 3(食品加工與安全國家級實驗教學(xué)示范中心，河南 洛陽，471023)

葡萄蒸餾酒是在20世紀(jì)末21世紀(jì)初新興的一種飲料酒[1]，是以葡萄為主要原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成的，它與世界六大蒸餾酒之一的白蘭地的區(qū)別在于沒有經(jīng)過橡木桶的貯藏陳釀，大大縮短了生產(chǎn)處理周期，最大程度的保留了釀造葡萄原有的香氣特點[2]，且價格適中，近年來深受消費者喜愛。

香氣是反映葡萄蒸餾酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[3]，也是影響人們選擇購買的主要因素。香氣成分的分析主要包括香氣成分的提取濃縮和分離檢測。GC-MS以其可以準(zhǔn)確、快速的定性、定量分析的特性已經(jīng)成為分析酒精飲料揮發(fā)性物質(zhì)最常見的方法[4]。無論使用多么先進的分析方法，將香氣物質(zhì)濃縮富集提取出來是獲得理想分析結(jié)果的前提[5]，固相微萃取技術(shù)是一種無溶劑萃取技術(shù)[6]，與液-液萃取等傳統(tǒng)技術(shù)相比，快速簡便，低成本，自動化且與多種分析系統(tǒng)兼容[7]。頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)作為固相微萃取的一種，在揮發(fā)性成分提取中更具有明顯的優(yōu)勢[8]，此外，通過將最少量、不需要的分子引入分析系統(tǒng)，可以使色譜柱獲得更長的壽命[9-10]。本文采取HS-SPME與GC-MS結(jié)合對葡萄蒸餾酒中的香氣成分進行提取與分析，為了能獲得更好的萃取效果，對影響HS-SPME萃取效果的各因素進行優(yōu)化。

近年來，對葡萄蒸餾酒的相關(guān)研究多集中在其發(fā)酵過程控制[11-12]、生產(chǎn)工藝優(yōu)化[13]和不同葡萄品種蒸餾酒香氣成分分析[14-15]，而對于香氣成分萃取條件優(yōu)化的研究較少，為更好地分析葡萄蒸餾酒中的揮發(fā)性香氣成分，本文對影響HS-SPME萃取效果的條件進行優(yōu)化，確定了葡萄蒸餾酒香氣成分萃取的較優(yōu)條件，以期為葡萄蒸餾酒的揮發(fā)性香氣成分研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗材料

酒樣(52°)，九朝雅宴葡萄蒸餾酒；2-辛醇(色譜純)，上海麥克林生化科技有限公司；NaCl(分析純)，天津化學(xué)試劑一廠；頂空瓶(20 mL)，北京博賽德科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TSQ9000氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技公司；萃取手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維(1 cm)，美國Supelco公司；ZNCL-TS磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氣相色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：AT.LZP-930白酒分析專用柱(30 m×0.32 mm，1 μm)；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：35 ℃ 保持5 min，然后以3 ℃/min升至60 ℃，再以2 ℃/min 升至135 ℃，最后以4 ℃/min升至220 ℃；載氣(He)流速2.0 mL/min，壓力30 kPa；不分流。

EI離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度240 ℃；采用全掃描模式，掃描的質(zhì)荷比范圍是35～600。

1.2.2 頂空固相微萃取條件

首先，由于三相纖維包含了不同性質(zhì)的萃取涂層，對酯類、醇類等多種化合物(C3～C20)具有足夠的提取能力[16]，所以選定萃取纖維為50/30 μm DVB/CAR/PDMS；在20 mL的鉗口瓶中加入稀釋到一定濃度的葡萄蒸餾酒8 mL、NaCl和磁力轉(zhuǎn)子，密封小瓶，在轉(zhuǎn)速為400 r/min下預(yù)熱平衡一段時間，插入萃取纖維進行頂空吸附一定時間，最后將其插入GC進樣口解析。

1.2.3 單因素試驗

以組分分離所得的色譜峰的總峰面積和峰個數(shù)為參考指標(biāo)，選取萃取溫度(20、30、40、50、60 ℃)、解析時間(2、4、6、8、10 min)、平衡時間(0、5、10、15、20 min)、萃取時間(10、20、30、40、50 min)、NaCl添加量(0、0.1、0.2、0.3、0.4 g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(5%、10%、15%、20%、25%)進行單因素試驗。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果并考慮到萃取纖維的使用壽命及前處理時間，確定解析和平衡時間，在此基礎(chǔ)上以各組分色譜圖的總峰面積(Y1)和峰個數(shù)(Y2)為響應(yīng)值，對萃取溫度(A)、萃取時間(B)、NaCl添加量(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D) 4個單因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.2.5 定性與定量分析

定性分析方法：將樣品的質(zhì)譜圖與賽默飛mainlib譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進行對比定性，保留匹配度>800的化合物。保留指數(shù)(retention index, RI)采用一系列正構(gòu)烷烴C7～C40計算，具體計算方法[17]如公式(1)所示：

(1)

式中：RIx，待分析化合物的保留指數(shù)；n，正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tx，待分析化合物的保留時間，min；tn，碳數(shù)為n的正構(gòu)烷烴的保留時間，min；tn+1，碳數(shù)為n+1的正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

定量分析方法：選用內(nèi)標(biāo)半定量法，通過內(nèi)標(biāo)物的峰面積與樣品中各組分的峰面積比值，計算各化合物的相對濃度，濃度計算如公式(2)所示：

(2)

式中：C1，待測化合物的質(zhì)量濃度，μg/mL；f，相對校正因子，f=1；A1，待測化合物的峰面積；A0，內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)的峰面積；C0，加入內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)的質(zhì)量濃度，μg/mL；V0，加入內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)的體積，mL；V1，萃取的8 mL稀釋酒樣的體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

按照上述的試驗方法進行試驗，每個試驗重復(fù)3次，計算峰個數(shù)和總峰面積，用Excel 2016、SPSS 25進行數(shù)據(jù)分析、Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 萃取溫度的選擇

樣品瓶中加入8 mL稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%的葡萄蒸餾酒、1.6 g NaCl進行磁力攪拌，在400 r/min下平衡10 min后插入萃取纖維，頂空萃取30 min，然后解析6 min，在此條件基礎(chǔ)上考察不同萃取溫度(20、30、40、50、60 ℃)對萃取效果的影響；由圖1可知，總峰面積和峰個數(shù)達到峰值時萃取溫度為30 ℃。加熱會加快樣品分子熱運動，使得揮發(fā)性香氣成分更好地釋放，從而增加其在頂空部位的濃度，但溫度的升高，會降低在涂層纖維上的分配系數(shù)，使得揮發(fā)性成分的吸附減少，且溫度過高時會使分子質(zhì)量大的難揮發(fā)性成分吸附，分子質(zhì)量小的易揮發(fā)性成分從萃取纖維上解析下來[18]。因此選擇30 ℃進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖1 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.1.2 解析時間的選擇

吸附到萃取纖維上的香氣成分能否更好地解析到氣相色譜中進行分析取決于解析時間，時間太短不僅會解析不充分，還會造成萃取纖維上較多殘留；時間過長可能會減少萃取纖維的使用次數(shù)，所以要確定合適的解析時間。由圖2可知，解析時間為2～6 min時，總峰面積和峰個數(shù)呈現(xiàn)出快速增加的趨勢，當(dāng)解析時間為6 min時，2個響應(yīng)值均達到峰值。隨著解析時間增加，萃取到的揮發(fā)性香氣成分不斷解析下來，但當(dāng)解析時間>6 min時，總峰面積和峰個數(shù)呈現(xiàn)出小幅下降的趨勢。因此，綜合分析，確定解析時間為6 min。

圖2 解析時間對萃取效果的影響Fig.2 Effect of desorption time on extraction efficiency

2.1.3 平衡時間的選擇

在萃取纖維進行吸附之前，樣品瓶中液相在30 ℃磁力攪拌條件下平衡一段時間，揮發(fā)性成分會在頂空和樣品之間達到平衡[19]，此時萃取效果較優(yōu)。由圖3可以看出，平衡時間為10 min時，響應(yīng)值達到極大值，萃取效果較好，兩者之間達到了平衡。因此，確定平衡時間為10 min。

圖3 平衡時間對萃取效果的影響Fig.3 Effect of equilibrium time on extraction efficiency

2.1.4 萃取時間的選擇

揮發(fā)性成分在萃取纖維上的吸附也是一個動態(tài)平衡的過程，是樣品、頂空部分和萃取纖維三者之間的平衡[20]，只有三者達到動態(tài)平衡時才有最大吸附量。由圖4可知，萃取時間為30 min時，總峰面積和峰個數(shù)達到極大值。相對分子質(zhì)量較低的物質(zhì)很容易被萃取吸附到萃取纖維上，反之，相對分子質(zhì)量較大的就很難被萃取，如果萃取時間過長，大分子物質(zhì)競爭性吸附增加會造成小分子物質(zhì)解析。萃取時間為30 min時，三相之間達到平衡，所以選擇萃取時間為30 min進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖4 萃取時間對萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.5 NaCl添加量的選擇

由圖5可知，當(dāng)NaCl添加量為0.2 g/mL時，揮發(fā)性成分總峰面積和峰個數(shù)達到極大值。加入NaCl會降低香氣物質(zhì)在液相中的溶解度，更易萃??；并且通過實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl添加量為0.2 g/mL時，溶液并未達到飽和狀態(tài)，可見并不是NaCl添加量越多越好，當(dāng)繼續(xù)添加NaCl至飽和或過飽和時，在增加揮發(fā)性成分氣-液分配比的同時也將影響基質(zhì)黏度，降低其擴散速度[21]。因此選擇NaCl添加量0.2 g/mL進行后續(xù)條件的優(yōu)化。

圖5 NaCl添加量對萃取效果的影響Fig.5 Effect of NaCl addition on extraction efficiency

2.1.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

由圖6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，揮發(fā)性成分的總峰面積和峰個數(shù)先增加后減少，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，揮發(fā)性成分總峰面積和峰個數(shù)達到極大值。乙醇是酒的主體成分且沸點較低，若不稀釋直接萃取，萃取纖維會吸附較多的乙醇，對酒中其他揮發(fā)性成分的吸附降低；并且在譜圖分析中，大乙醇峰會使其他化合物峰后移[4]，影響香氣物質(zhì)的分析。將酒樣進行不同濃度的稀釋后，會縮小提取過程中乙醇與其他香氣成分之間的競爭性吸附差異，但稀釋濃度過大，乙醇與其他香氣成分濃度過低，使總體萃取效果降低，由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，萃取效果較好。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對萃取效果的影響Fig.6 Effect of ethanol volume fraction on extraction efficiency

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

利用Design-Expert.V8.0進行Box-Behnken試驗設(shè)計，試驗結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

通過對表1結(jié)果進行二元多次回歸統(tǒng)計分析，建立回歸模型，此模型得出葡萄蒸餾酒中香氣成分的總峰面積(Y1)、峰個數(shù)(Y2)與各變量因素之間的擬合方程為：

Y1=3.449×108+2.897×106A+7.730×106B+2.510×106C+4.828×106D-1.178×106AB-3.242×107AC-2.481×107AD+1.011×105BC+6.771×106BD+6.734×106CD-3.362×107A2-2.737×107B2-4.262×107C2-6.598×107D2

Y2=33.40+0.75A+0.58B+1.25C-0.42D-0.75AB-AC-AD-0.5BD-1.25CD-3.33A2-1.33B2-2.07C2-2.07D2。

為了檢驗方程的有效性，對結(jié)果進行方差分析(表2)。由表2可知，對于總峰面積和峰個數(shù)兩個響應(yīng)值，模型的P值均<0.000 1，說明模型極顯著；模型失擬誤差P值均>0.05，說明模型失擬項不顯著，試驗誤差較小。對模型進行可信度分析可知，模型響應(yīng)值總峰面積和峰個數(shù)的決定系數(shù)R2分別為0.989 8、0.926 7，校正后R2分別為0.979 6、0.853 4，表明模型擬合度高；模型的變異系數(shù)均<10%，說明模型對響應(yīng)值的置信度良好，可以較好地反映真實的實驗結(jié)果。綜上所述，該回歸模型對2個響應(yīng)值的擬合度較高，能夠較好的反應(yīng)響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

Design-Expert.V8.0軟件對試驗的優(yōu)化結(jié)果為萃取溫度30.02 ℃、萃取時間31.76 min、NaCl添加量0.21 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)10.81%。采用優(yōu)化后的參數(shù)進行驗證試驗，為方便操作將優(yōu)化后的條件適當(dāng)調(diào)整為萃取溫度30 ℃、萃取時間30 min、NaCl添加量0.20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，平行試驗3次取平均值，測得總峰面積為3.494×108，與模型3.513×108無明顯差異，峰個數(shù)為34，與模型33相近，說明優(yōu)化后的萃取條件存在可行性。

2.3 葡萄蒸餾酒香氣成分分析結(jié)果

在8 mL稀釋的酒樣中添加50 μL、400 μg/mL的2-辛醇(內(nèi)標(biāo))，使用優(yōu)化后的萃取條件對葡萄蒸餾酒中的香氣成分進行檢測，并計算其保留指數(shù)，具體香氣成分見表3。

3 結(jié)論

本實驗通過HS-SPME與GC-MS結(jié)合測葡萄蒸餾酒揮發(fā)性成分，對影響萃取效果的因素進行了單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得到了頂空固相微萃取的較優(yōu)萃取條件：萃取溫度30 ℃、解析時間6 min、平衡時間10 min、萃取時間30 min、NaCl添加量0.20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%。對優(yōu)化后的條件進行驗證，該條件下進行萃取得到總峰面積為3.494×108，峰個數(shù)為34，表明該萃取條件試驗效果好，具有一定的通用性。在優(yōu)化條件下從葡萄蒸餾酒中鑒定出酯類物質(zhì)16種，醇類6種，醛類1種、酚類1種。本研究優(yōu)化的測定方法簡單、快速，在葡萄蒸餾酒及其他酒類香氣成分分析中具有較好的應(yīng)用前景。