賴長(zhǎng)龍，曹余，楊玉，李紅艷，范亞葦，鄧澤元

(南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一種兼性厭氧細(xì)菌，在缺氧條件下能夠進(jìn)行發(fā)酵，將糖轉(zhuǎn)化為乳酸[1]。乳酸菌有多種健康益處，包括替代抗生素、降低膽固醇水平、維持腸道菌群平衡和提高免疫力[2-3]。據(jù)國(guó)際乳業(yè)聯(lián)合協(xié)會(huì)建議，食品中益生菌活菌數(shù)最低為107CFU/g或107CFU/mL，以確保益生菌對(duì)宿主發(fā)揮有益作用[4]。因此，生產(chǎn)上通過(guò)高密度培養(yǎng)(high cell density culture，HCDC)來(lái)獲得足夠數(shù)量的益生菌，以發(fā)揮其促進(jìn)宿主健康的作用。乳酸菌的生長(zhǎng)受培養(yǎng)基組成、pH、溫度、接種量和代謝產(chǎn)物的影響較大[5]。由于乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求非常嚴(yán)格，因此需要豐富的培養(yǎng)基來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)。在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方法中，響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)得到了廣泛的應(yīng)用[6]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network，ANN)是一種基于生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的計(jì)算模型，在非線性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)建模上具有較高的精度和泛化能力[7]。一些研究表明，ANN相較于RSM在發(fā)酵條件優(yōu)化方面具有更好的擬合效果[8]。遺傳算法(genetic algorithm，GA)是一種基于達(dá)爾文“適者生存”理念的啟發(fā)式優(yōu)化算法，采用遺傳算子如選擇、突變和交叉，以找到最優(yōu)的問(wèn)題解決方案[9]。在最近的研究中，ANN-GA混合模型已被證明預(yù)測(cè)精度高，穩(wěn)定性好[10]。高密度培養(yǎng)主要通過(guò)添加堿性溶液控制培養(yǎng)基pH來(lái)降低酸抑制作用。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)分批補(bǔ)料策略來(lái)提高菌體產(chǎn)量[11]。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)植物乳桿菌的碳源、氮源和緩沖鹽進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)基于響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用ANN-GA混合模型對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行模擬，建立了發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程。在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，通過(guò)間歇補(bǔ)料方式，進(jìn)一步提高菌體產(chǎn)量，為植物乳桿菌的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，分離自江西省萍鄉(xiāng)市成品搓菜，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，檸檬酸二銨2，葡萄糖10，Tween-80 l mL，磷酸氫二鉀2，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·H2O 0.25，自然pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HWS-150型恒溫恒濕箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雷磁PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；EXL800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek Instruments有限公司；THZ-82 N臺(tái)式恒溫振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；AR1140電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與指標(biāo)測(cè)定

L.plantarum菌種保藏于甘油凍存管中，每次實(shí)驗(yàn)前將菌種以3%接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，活化2代。

菌體生物量的測(cè)定采用烘干法，即取一定量發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min去除上清液，用生理鹽水洗滌菌體2次，于105 ℃烘干至恒重后稱量[12]。然后，將OD600值轉(zhuǎn)換成菌體干重(dry cell weight，DCW)，由實(shí)驗(yàn)測(cè)定，DCW(g/L)=10.87×OD600-0.096 9。

還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測(cè)定[13]。簡(jiǎn)要地，取1 mL稀釋發(fā)酵液，加入2 mL DNS試劑于100 ℃下水浴5 min。冷卻后定容至15 mL，于540 nm測(cè)定吸光度。

乳酸含量采用紫外分光光度法測(cè)定[14]。用離心機(jī)將發(fā)酵液從菌體中分離出來(lái)，上清液用去離子水稀釋10倍。取50 μL稀釋后的上清液加入到2 mL的2 g/L氯化鐵溶液中，在390 nm下測(cè)定吸光度。

1.3.2 碳源、氮源和緩沖鹽優(yōu)化

以植物乳桿菌為研究對(duì)象，在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)不同種類的碳源、氮源和緩沖鹽進(jìn)行了優(yōu)化，用20 g/L的不同碳源和25 g/L的不同氮源分別替代MRS培養(yǎng)基中已有的碳源或氮源，而所有其他成分保持在固定水平。通過(guò)測(cè)定生物量確定不同物質(zhì)對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)作用。

1.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用RSM中的中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)基的碳源、氮源、緩沖鹽進(jìn)行優(yōu)化，以菌體生物量為響應(yīng)值，確定培養(yǎng)基中主要成分的最優(yōu)配比。其中碳源含量(X1)、氮源含量(X2)、檸檬酸二銨含量(X3)為自變量，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 CCD參數(shù)水平設(shè)計(jì)Table 1 Levels of CCD parameter design

1.3.4 ANN模型

ANN是一種受大腦和神經(jīng)系統(tǒng)研究啟發(fā)的數(shù)學(xué)算法。它可以連接輸入和輸出參數(shù)，通過(guò)迭代從示例中學(xué)習(xí)，而不需要關(guān)于過(guò)程變量之間關(guān)系的先驗(yàn)知識(shí)[15]。隱藏層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為tansig，輸出層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為purelin，采用trainbr方法進(jìn)行訓(xùn)練，當(dāng)均方誤差(mean square error，MSE)達(dá)到1×10-3時(shí)，訓(xùn)練停止[16]。通過(guò)試錯(cuò)法，比較不同神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)實(shí)際值的能力，確定隱藏層神經(jīng)元的數(shù)量。在此過(guò)程中，采用MSE作為質(zhì)量參數(shù)，在不同結(jié)構(gòu)中選擇最優(yōu)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)選擇碳源(X1)、氮源(X2)和緩沖鹽(X3)作為模型輸入，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，以菌體生物量作為模型輸出，建立單隱藏層和雙隱藏層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過(guò)比較單隱藏層和雙隱藏層結(jié)構(gòu)的MSE，確定最優(yōu)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。MSE的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：N為樣本數(shù)量；Yp,i為預(yù)測(cè)值；Ya,i為實(shí)際值。

1.3.5 GA

GA已經(jīng)證明了它能夠以最優(yōu)性能優(yōu)化各種線性和非線性問(wèn)題，該算法基于自然進(jìn)化原理，利用交叉和變異來(lái)保持最優(yōu)個(gè)體的生存[17]。ANN-GA混合算法模型將訓(xùn)練好的ANN網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，以菌體干重為響應(yīng)變量，通過(guò)尋找全局最優(yōu)解，獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組合。遺傳算法參數(shù)設(shè)定如下：變量類型為實(shí)數(shù)型，種群大小50，最大迭代數(shù)500，交叉概率0.8，變異概率0.1。

1.3.6 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型主要有結(jié)構(gòu)化和非結(jié)構(gòu)化模型，與結(jié)構(gòu)化模型相比，非結(jié)構(gòu)化模型更易于對(duì)間歇發(fā)酵進(jìn)行預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)[18]。根據(jù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，建立植物乳桿菌的菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物生成模型，每隔2 h測(cè)定其培養(yǎng)過(guò)程中的生物量、乳酸和殘?zhí)橇?，?jì)算出動(dòng)力學(xué)模型的參數(shù)，預(yù)測(cè)其發(fā)酵過(guò)程變化。

對(duì)于菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，Logistic方程是一個(gè)與底物無(wú)關(guān)的模型，可以很好地描述微生物生長(zhǎng)過(guò)程[19]。菌體生長(zhǎng)Logistic方程的表達(dá)如公式(2)所示：

(2)

式中：X，菌體生物量，g/L；X0，菌體初始生物量，g/L；Xm，菌體最大生物量，g/L；μm，最大比生長(zhǎng)速率，g/(L·h)；t，時(shí)間，h。

植物乳桿菌產(chǎn)物生成模型符合“S”型曲線，使用Logistic方程預(yù)測(cè)產(chǎn)物生成模型，方程的表達(dá)如公式(3)所示：

(3)

式中：P，菌體乳酸含量，g/L；P0，菌體初始乳酸含量，g/L；Pm，菌體最大乳酸含量，g/L；μm1，最大比生成速率，g/(L·h)；t，時(shí)間，h。

植物乳桿菌底物消耗動(dòng)力學(xué)使用Luedeking-Piret模型，該模型既考慮了菌體自身維持生長(zhǎng)的底物消耗，也考慮了底物向菌體生物量和代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化[5]。鑒于菌體用于維持自身的底物消耗遠(yuǎn)低于菌體生物量和產(chǎn)物生成量的底物消耗，故對(duì)Luedeking-Piret模型進(jìn)行簡(jiǎn)化，方程的表達(dá)如公式(4)所示：

(4)

式中：S，殘?zhí)橇?，g/L；S0，初始?xì)執(zhí)橇?，g/L；YX/S，菌體得率系數(shù)，g/g；YP/S，產(chǎn)物得率系數(shù)，g/g；t，時(shí)間，h。

1.3.7 培養(yǎng)條件和分批補(bǔ)料優(yōu)化

以植物乳桿菌菌體干重為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)溫度、初始pH和接種量進(jìn)行優(yōu)化，繪制其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行補(bǔ)料優(yōu)化，采用間歇補(bǔ)料方式，研究中和劑、補(bǔ)料濃度和補(bǔ)料次數(shù)對(duì)菌體密度的影響。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行測(cè)定，響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用Design-Expert軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析，ANN和GA分別采用R語(yǔ)言中的NeuralNetTools和GA開(kāi)源軟件包[20-21]，使用Origin進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源和氮源優(yōu)化

不同種類的碳源和氮源對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響如圖1所示。圖1-a顯示，麥芽糖對(duì)菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為顯著，生物量最高可達(dá)6.38 g/L，葡萄糖和麥芽糖(質(zhì)量比2∶3)次之，菌體量可達(dá)6.28 g/L。可以發(fā)現(xiàn)，相較于葡萄糖，麥芽糖對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)效果更好，可能是因菌體快速利用葡萄糖產(chǎn)酸，降低培養(yǎng)基的pH，抑制其自身的生長(zhǎng)?？紤]到單獨(dú)使用麥芽糖的成本較高，因此選擇葡萄糖和麥芽糖作為最佳碳源。如圖1-b所示，有機(jī)氮源顯著優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，而當(dāng)選擇酵母粉和蛋白胨(質(zhì)量比1∶1)為氮源時(shí)，菌體最大產(chǎn)量為6.7 g/L。一些研究表明，酵母粉和低成本的蛋白胨作為氮源時(shí)，對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)有顯著影響[22]。相較于使用單一氮源，酵母粉復(fù)合大分子肽的蛋白胨對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。不同濃度的復(fù)合碳源和復(fù)合氮源對(duì)菌體的生長(zhǎng)有著重要的影響。復(fù)合碳源質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，菌體最大產(chǎn)量為6.96 g/L(圖1-c)。復(fù)合氮源質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，菌體最大產(chǎn)量為7.27 g/L(圖1-d)。

a-碳源種類優(yōu)化；b-氮源種類優(yōu)化；c-復(fù)合碳源濃度優(yōu)化；d-復(fù)合氮源濃度優(yōu)化圖1 不同碳源和氮源對(duì)植物乳桿菌生物量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources and nitrogen source on the biomass of L.plantarum

2.2 緩沖鹽優(yōu)化

乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中代謝碳水化合物生成乳酸，降低培養(yǎng)基pH，抑制菌體生長(zhǎng)[23]。在培養(yǎng)基中添加緩沖鹽可以在一定程度上平衡pH，降低對(duì)菌體的抑制作用。本研究對(duì)不同濃度的緩沖鹽體系進(jìn)行了研究，如表2所示，菌體量最初隨著緩沖鹽濃度的增加而增加，但隨后隨著緩沖鹽濃度的增加而減少?？梢钥吹剑?dāng)檸檬酸二銨質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，培養(yǎng)基緩沖效果最好，菌體生物量可達(dá)6.46 g/L。

表2 不同緩沖鹽體系對(duì)菌體生物量的影響Table 2 Effects of different buffer systems on bacterial biomass

2.3 ANN模型建立

本研究以CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練樣本，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立ANN模型(表3)。對(duì)于構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，首先需要確定最優(yōu)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如圖2-a和圖2-b所示，單隱藏層神經(jīng)元數(shù)量為9時(shí)，MSE最小為0.009 1。雙隱藏層神經(jīng)元數(shù)量為7和9時(shí)，MSE最小為0.024 2。如圖2-c所示，單隱藏層模型相較于雙隱藏層模型對(duì)生物量擬合效果更好，MSE分別為0.009 4 和0.161 7。因此，本研究選用單隱藏層網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)構(gòu)模型如圖3-a所示。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在優(yōu)化發(fā)酵條件方面取得了很大的成功，YANG等[15]利用ANN建立協(xié)同發(fā)酵法以提高真菌蒽醌產(chǎn)量和抗氧化活性，蒽醌產(chǎn)量提高至2.11%。

2.4 GA優(yōu)化

將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型作為GA的適應(yīng)度函數(shù)，采用GA求解器進(jìn)行過(guò)程優(yōu)化，從而得到問(wèn)題最優(yōu)解[24]。如圖3-b所示，經(jīng)過(guò)369次迭代，確定了植物乳桿菌生物量最佳輸入條件，分別是復(fù)合碳源36.64 g/L、復(fù)合氮源47.83 g/L和檸檬酸二銨33.27 g/L，輸出值為11.02 g/L。同時(shí)，在最優(yōu)條件下的生物量實(shí)驗(yàn)值為10.86 g/L，誤差值<2%。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合較好，說(shuō)明所生成的ANN-GA模型具有良好的預(yù)測(cè)和優(yōu)化能力。

表3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Training experimental design for BP neural network

a-單隱藏層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)MSE；b-雙隱藏層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)MSE；c-單隱藏層和雙隱藏層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值比較圖2 ANN模型的確定Fig.2 Determination of the ANN model

2.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

2.5.1 發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)曲線

如圖3-c所示為植物乳桿菌在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下細(xì)胞干重、殘?zhí)橇?、pH和乳酸變化情況。在0～4 h，菌體處于滯后期，由于初始糖含量較高，基質(zhì)消耗多用于菌體自身的乳酸代謝，導(dǎo)致細(xì)胞干重變化較小，發(fā)酵液pH迅速降至4.3左右。在4～20 h，菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，糖含量降至4 g/L，pH為3.7左右，細(xì)胞干重迅速增加。在培養(yǎng)30 h后，獲得最大細(xì)胞干重10.59 g/L，乳酸含量增至19.78 g/L。可以看到，發(fā)酵液乳酸含量和殘?zhí)橇吭?6 h趨于穩(wěn)定，菌體對(duì)數(shù)期最大生長(zhǎng)速率為0.292 g/(L·h)。

a-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模型；b-GA最優(yōu)值和平均值迭代優(yōu)化；c-發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線圖3 ANN-GA模型優(yōu)化和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 ANN-GA model optimization and fermentation kinetic curve

2.5.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合

根據(jù)公式(2)，對(duì)生物量進(jìn)行模型擬合，得到生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)X0=0.512 g/L，Xm=10.63 g/L，μm=0.292 g/(L·h)。如圖4-a所示，R2=0.995，說(shuō)明Logistic方程可以很好地描述該發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。乳酸菌發(fā)酵通過(guò)碳水化合物代謝產(chǎn)生乳酸作為主要的代謝最終產(chǎn)物，乳酸的積累是抑制其自身生長(zhǎng)的主要因素[25]。根據(jù)公式(3)，對(duì)產(chǎn)物生成進(jìn)行模型擬合，得到產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)P0=0.51 g/L，Pm=19.768 g/L，μm1=0.394 g/(L·h)。如圖4-b所示，R2=0.998，說(shuō)明該方程對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)物生成擬合較好。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，底物主要轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)量、產(chǎn)物和維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)[26]。根據(jù)公式(4)，對(duì)底物消耗進(jìn)行模型擬合，得到底物消耗動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)S0=33.967 g/L，YX/S=1.755 g/g，YP/S=0.753 g/g。如圖4-c所示，R2=0.993，Luedeking-Piret方程很好地描述了底物消耗動(dòng)力學(xué)。

a-生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線；b-產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線；c-底物消耗動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線圖4 植物乳桿菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程擬合Fig.4 Fermentation kinetic equation fitting of L.plantarum

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)研究了不同初始pH、發(fā)酵溫度和接種量對(duì)植物乳桿菌生物量的影響。由圖5-a可知，在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)，植物乳桿菌生長(zhǎng)效果最好。在35 ℃時(shí)，初始pH和接種量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)影響顯著。最適初始pH因菌種而異，乳酸菌有一定的耐酸性，如圖5-b所示，在pH=5.0時(shí)有最高的菌體量，隨著培養(yǎng)基初始pH升高，菌體生長(zhǎng)也受到抑制。此外，接種量也是乳酸菌生長(zhǎng)的重要參數(shù)，在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)保持在最優(yōu)值。由圖5-c可知，接種量為4%時(shí)，菌體生長(zhǎng)效果最好。當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌體量下降，可能是由于接種量過(guò)大，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量菌體同時(shí)生長(zhǎng)。

2.7 分批補(bǔ)料優(yōu)化

分批補(bǔ)料是發(fā)酵工業(yè)中提高生產(chǎn)效率最常用的方法之一。菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，對(duì)碳源的需求量較大，可通過(guò)補(bǔ)加碳源以提高產(chǎn)量。乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生有機(jī)酸快速降低環(huán)境pH，影響細(xì)胞膜滲透性和胞內(nèi)酶活性，流加中和劑以保持良好的發(fā)酵條件[19]。如圖6-a所示，NH3·H2O能顯著提高培養(yǎng)液中的菌體密度。本實(shí)驗(yàn)研究了補(bǔ)加不同濃度的葡萄糖對(duì)乳酸菌生物量的影響，由圖6-b可知，過(guò)高的葡萄糖導(dǎo)致菌體產(chǎn)量降低，當(dāng)補(bǔ)加葡萄糖至30 g/L時(shí)，菌體生物量最大。同時(shí)對(duì)葡萄糖補(bǔ)料次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，如圖6-c所示，單次補(bǔ)料生物量最大?？梢园l(fā)現(xiàn)，多次補(bǔ)加葡萄糖并未增加菌體生物量，一些研究表明，在分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌菌體產(chǎn)量主要受到產(chǎn)物抑制的影響[27]。因此，植物乳桿菌通過(guò)補(bǔ)入葡萄糖和NH3·H2O，菌體干重可達(dá)12.64 g/L。如圖6-d所示，分批補(bǔ)料的菌體產(chǎn)量較未補(bǔ)料提高了19%。

a-不同溫度對(duì)植物乳桿菌生物量的影響；b-不同初始pH對(duì)植物乳桿菌生物量的影響；c-不同接種量對(duì)植物乳桿菌生物量的影響圖5 植物乳桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of fermentation conditions for L.plantarum

a-不同中和劑對(duì)生物量的影響；b-葡萄糖濃度優(yōu)化；c-補(bǔ)料方式對(duì)生物量的影響；d-補(bǔ)料培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響圖6 植物乳桿菌分批補(bǔ)料優(yōu)化Fig.6 Fed-batch optimization of L.plantarum

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及高密度培養(yǎng)進(jìn)行了研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定植物乳桿菌生長(zhǎng)所需的最佳碳源、氮源和緩沖鹽，利用ANN-GA模型對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化，培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為碳源36.64 g/L(葡萄糖-麥芽糖質(zhì)量比2∶3)、氮源47.83 g/L(酵母粉-蛋白胨質(zhì)量比1∶1)、檸檬酸二銨33.27 g/L。根據(jù)植物乳桿菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線得到菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成及底物消耗動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.995、0.996、0.996，表明建立的模型能很好地預(yù)測(cè)植物乳桿菌發(fā)酵過(guò)程變化情況。基于最佳培養(yǎng)基配方，對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)條件和補(bǔ)料方式進(jìn)行了優(yōu)化，菌體產(chǎn)量可達(dá)12.64 g/L。