李玉珍，肖懷秋,*，王琳，劉淼，曾夢(mèng)琪，曹丹，趙謀明

1(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株州，412000)2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510000)

食品加工和流通過程中易引入致病病原菌，大腸埃希菌(Escherichiacoli)是典型的食源性革蘭氏陰性菌，細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有典型性和代表性，是最常見的低感染劑量、高致病性腸道病原體，可引起腹瀉和出血性結(jié)腸炎等消化道疾病，是食品公共衛(wèi)生領(lǐng)域的嚴(yán)重威脅，常作為模式菌株進(jìn)行研究。葡萄糖氧化供能是微生物普遍存在的能量代謝途徑，也是脂肪與蛋白質(zhì)等生物大分子的終極代謝途徑。葡萄糖氧化代謝途徑關(guān)鍵酶若受到抑制，能量生成會(huì)受到影響并影響菌體正常生長(zhǎng)[1]。大腸埃希菌通過葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)生成磷酸葡萄糖[2]，經(jīng)糖酵解(embden-meyerhof-parnas，EMP)途徑生成丙酮酸，EMP途徑關(guān)鍵酶有己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)。丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶系(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)脫羧脫氫生成乙酰CoA，再與草酰乙酸縮合生成檸檬酸進(jìn)入三羧酸(tricarboxylic acid cycle，TCA)循環(huán)并完成葡萄糖徹底氧化，TCA途徑關(guān)鍵酶有檸檬酸合成酶(citrate synthase，CS)、異檸檬酸脫氫酶(isocitric dehydrogenase，IDH)和α-酮戊二酸脫氫酶系(α-ketoglutaric dehydrogenase complex，α-KGDHC)[3]。ZHAO等[4]研究了月桂酸鹽對(duì)大腸埃希菌細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷的膜損傷機(jī)理，陳旋等[5]和SHI等[6]分別研究了抗菌肽P7和烷基甘油酯對(duì)大腸埃希菌的非細(xì)胞質(zhì)膜損傷機(jī)理。由于細(xì)胞膜作為抗菌靶點(diǎn)可解決現(xiàn)有抗生素難以徹底殺滅減速生長(zhǎng)期與休眠期細(xì)菌這一關(guān)鍵問題，且細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對(duì)保守和快速殺菌效應(yīng)使得細(xì)胞膜效應(yīng)靶點(diǎn)具有天然優(yōu)勢(shì)[7]；此外，由于細(xì)菌細(xì)胞膜組分與真核生物細(xì)胞膜組分的差異使得以細(xì)胞膜作為效應(yīng)靶點(diǎn)具有更好細(xì)胞選擇性，且不易產(chǎn)生耐藥性[8]，目前抑菌機(jī)理以細(xì)胞質(zhì)膜靶點(diǎn)研究為主[9]。前期研究表明，金抗肽SIF4對(duì)大腸埃希菌有較好抑菌活性[4]，但抑菌機(jī)理不明。課題組認(rèn)為，雖然細(xì)胞膜是抗菌肽優(yōu)選效應(yīng)靶點(diǎn)，但基于能量代謝關(guān)鍵酶靶點(diǎn)的非細(xì)胞質(zhì)膜損傷研究也同樣具有重要意義，特別是基于細(xì)胞質(zhì)膜/非細(xì)胞質(zhì)膜損傷靶點(diǎn)的協(xié)同抑菌機(jī)理研究更具重要意義[10]，試驗(yàn)研究了金抗肽SIF4對(duì)菌體糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑關(guān)鍵酶、細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷和細(xì)胞內(nèi)源活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成的影響，以期從細(xì)胞質(zhì)膜/非細(xì)胞質(zhì)膜損傷這一視角揭示SIF4對(duì)大腸埃希菌抑菌機(jī)理，為食源性大腸埃希菌生物防控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

金抗肽SIF4，實(shí)驗(yàn)室制備；大腸埃希菌ATCC25922從菌種保藏中心獲得；牛肉膏、胰蛋白胨，北京博星；磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、ATP、ADP、NADH、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等，上海源葉；醛縮酶、乳酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、PK、HK、PFK、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、草酰乙酸、二硫雙對(duì)硝基苯甲酸、硫代巴比妥酸等，Sigma；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，島津；Infinite F200 pro多功能酶標(biāo)儀，Tecan。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金抗肽SIF4處理與粗酶液制備

將活化菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(12 h)，準(zhǔn)確吸取5 mL 菌液接種至45 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入SIF4至終質(zhì)量濃度為0、1/2、1和2 MIC[(最小抑菌濃度，minimum inhibitory concentration)，MIC=0.4 mg/L]，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)12 h，間隔4 h取1 mL培養(yǎng)物，4 500 r/min離心10 min，收集菌體，用1%(體積分?jǐn)?shù)) TritonX-100的PBS懸浮細(xì)胞并超聲處理30 min(200 W，超聲5 s，間隔9 s)，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，細(xì)胞破碎上清液即粗酶液，粗酶液蛋白質(zhì)用Bradford法[11]測(cè)定。

1.2.2 糖酵解代謝途徑關(guān)鍵酶活性測(cè)定

利用NADH和NADPH在340 nm處有光吸收并產(chǎn)生熒光，而NAD+和NADP+無此特性，用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值并計(jì)算酶活力。

(1)HK活性測(cè)定：參考SKARLATOS等[12]方法并稍做修改。移取0.5 mL酶液加入2.0 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0，含100 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L NADP+，1.2 mmol/LATP，300 mmol/L葡萄糖)，5 μg 6-磷酸脫氫酶，25 ℃反應(yīng)5 min，以不添加ATP組為空白。

(2)PFK活性測(cè)定：參考KOTLARZ等[13]方法并稍做修改。移取0.5 mL酶液加入2.0 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液[pH 8.0，含30 mmol/L MgCl2，60 mmol/L KCl，0.12 mmol/L NADPH，1.0 mmol/L ATP，0.2 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，1.0 mmol/L AMP，0.5 mmol/L 6-磷酸果糖]，加丙酮酸激酶50 μg，20 U乳酸脫氫酶，以不添加6-磷酸果糖組為空白。

(3)PK活性測(cè)定：參考MILLAR等[14]方法并稍做修改。移取0.5 mL酶液加入2.0 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，含1.2 mmol/L ADP，0.18 mmol/L NADH，150 mmol/L KCl，12 mmol/L MgCl2，1.1 mmol/L PEP)，20 U乳酸脫氫酶，以不添加PEP組為空白。

1.2.3 TCA循環(huán)途徑關(guān)鍵酶活性測(cè)定

(1)PDHC提取與測(cè)定：參考JENNER等[15]方法并稍做修改。取1 mL粗酶液加入1 mL酶提取液[pH 7.5，含80 mmol/L Na4P2O7，10 mmol/L K3PO4，0.3 mol/L甘露醇，10.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，10.0 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，2 mmol/L EDTA，25 mmol/L Cys]中，2 000 r/min離心5 min，上清液15 000 r/min離心20 min，將沉淀重懸浮于1 mL TES緩沖液(10 mmol/L Tes-KOH，pH 7.5，0.3 mol/L甘露醇，1.0 g/L BSA)，30 000 r/min離心45 min，上清液即為PDHC粗提液；取100 μL酶粗提液加入至2 mL酶反應(yīng)液[pH 7.5，75 mmol/L HEPES-NaOH，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NAD+，0.2 mmol/L CoA，2 mmol/L 焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate，TPP)，10 mmol/L Cys]，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L丙酮酸鈉激發(fā)反應(yīng)，測(cè)定340 nm光吸收值變化。

(2)CS提取與測(cè)定：參考JENNER等[15]和HIRAI等[16]方法并稍作修改。取1 mL粗酶液加入1 mL酶提取液[pH 7.3，含30 mmol/L HEPES-NaOH，10 mmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，1 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L EDTA，5.0 g/L BSA，5.0 g/L PVP，10 mmol/L Cys]，勻漿2 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即CS粗提液[15]；取100 μL酶粗提液加入2 mL反應(yīng)液(pH 9.0，含40 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L 二硫代二硝基苯甲酸，80 μmol/L 乙酰CoA)，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L草酰乙酸激發(fā)反應(yīng)，測(cè)定412 nm光吸收值變化。

(3)IDH提取與測(cè)定：參考JENNER等[15]方法并稍作修改。取1 mL粗酶液加入1 mL提取液(pH 6.9，含25 mmol/L HEPES-NaOH，1 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，25%甘油，2.5 g/L BSA，2.5 g/L PVP，0.1%(體積分?jǐn)?shù)) TritonX-100，100 mmol/L檸檬酸鈉)，勻漿2 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即IDH粗提液；取100 μL酶粗提液加入2 mL反應(yīng)液[pH 7.6，含40 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L NAD+，10 mmol/L MnCl2，0.05%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100]，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L異檸檬酸鈉激發(fā)反應(yīng)，測(cè)定340 nm光吸收值變化。

(4)α-KGDHC提取與測(cè)定：參考PEKOVICH等[17]方法并稍作修改。取1 mL粗酶液加入1 mL酶提取液[pH 7.5，含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，0.01%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100，0.2 g/L脫氧膽酸鈉，0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟]，勻漿2 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即α-KGDHC粗提液；取100 μL酶粗提液加入2 mL反應(yīng)液[pH 8.0，含50 mmol/L 3-嗎啉丙磺酸，2 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L CoA，10 mmol/L NAD+，0.5%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100，0.04 mmol/L魚藤酮]，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L α-酮戊二酸激發(fā)反應(yīng)，測(cè)定340 nm光吸收值變化。

1.2.4 對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5(約5×107CFU/mL)，加入SIF4至終質(zhì)量濃度為0、1/2、1和2 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，間隔4 h取樣1 mL培養(yǎng)物與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)等體積混合，煮沸15 min后立即轉(zhuǎn)入冰水浴中，室溫條件下12 000 r/min離心10 min。取300 μL上清液分別測(cè)定450、532、600 nm光吸收值并計(jì)算丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量[18],如公式(1)所示：

MDA/(nmol·mg-1protein) =10×[6.45×(A532-A600)-0.56×A450]

(1)

1.2.5 對(duì)細(xì)胞內(nèi)源ROS生成的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5，加入SIF4至終質(zhì)量濃度為0、1/2、1和2 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，間隔4 h取樣1 mL培養(yǎng)物，6 500 r/min離心10 min，菌體沉淀用無菌PBS洗滌3次并重懸，向各組樣液加入100 μL 10 μmol/L 2.7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)溶液，37 ℃，120 r/min避光孵育1 h，測(cè)定488 nm處細(xì)胞懸液熒光強(qiáng)度以判定細(xì)胞內(nèi)源ROS水平[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1 對(duì)HK的影響

HK是糖酵解途徑第1個(gè)關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)ATP磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至葡萄糖C6生成6-磷酸葡萄糖，需Mg2+或Mn2+參與。SIF4對(duì)HK活性的影響如圖1所示。

圖1 SIF4對(duì)己糖激酶的影響Fig.1 The effect of SIF4 on HK注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

由圖1可知，處理0～12 h時(shí)，1/2MIC組對(duì)HK活性影響不顯著(P>0.05)，隨著SIF4處理劑量的增加，HK活性顯著降低(P<0.05)，特別是2MIC組，可能是由于HK為別構(gòu)酶，SIF4對(duì)HK的別構(gòu)抑制效應(yīng)存在量效關(guān)系[20]，SIF4可能通過與HK的別構(gòu)亞基結(jié)合而影響酶活性，從而對(duì)EMP實(shí)施調(diào)控，與其他小分子物質(zhì)對(duì)HK活性影響機(jī)制相似[21]。2MIC組處理4、8、12 h時(shí)，HK活性分別降至對(duì)照組的53.23%、41.94%和33.39%。

2.1.2 對(duì)PFK的影響

PFK負(fù)責(zé)催化6-磷酸果糖為1,6-二磷酸果糖，pfkA和pfkB基因可編碼同工酶Ⅰ和Ⅱ，PFK I約占90%，是糖酵解途徑第2個(gè)關(guān)鍵酶和標(biāo)志酶[22]。SIF4對(duì)PFK的影響如圖2所示。

圖2 SIF4對(duì)磷酸果糖激酶的影響Fig.2 The effect of SIF4 on PFK

由圖2可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組PFK活性均存在顯著差異(P<0.05)。SIF4處理劑量(x)與PFK活性(y)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，1/2、1和2 MIC組線性回歸方程分別為y=-0.003x+0.254 5(R2=0.948 2)、y=-0.003 8x+0.245 5(R2=0.704 6)和y=-0.005 5x+0.237 6(R2=0.574 7)。隨著SIF4處理劑量增加，線性關(guān)系變差，特別是處理劑量較大時(shí)，SIF4在較短時(shí)間內(nèi)就可對(duì)PFK實(shí)現(xiàn)較好抑制，如2MIC組處理4 h時(shí)，PFK活性降至對(duì)照組的76.68%，處理時(shí)間延長(zhǎng)至8 h和12 h時(shí)，抑制活性僅分別增加3.93%和4.05%；PFK是由4個(gè)亞基組成的別構(gòu)酶，亞基中除有6-磷酸果糖和ATP結(jié)合位點(diǎn)外，還存在幾個(gè)與激活劑(或抑制劑)結(jié)合的別構(gòu)位點(diǎn)，對(duì)PFK的抑制作用可能與小分子金抗肽SIF4可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PFK亞基而發(fā)揮別構(gòu)抑制效應(yīng)有關(guān)[13]。

2.1.3 對(duì)PK的影響

PK負(fù)責(zé)催化PEP生成丙酮酸和ATP，是糖酵解最后一個(gè)關(guān)鍵酶，pykF和pykA基因可編碼PK同工酶Ⅰ和Ⅱ，以PK I為主[23]。SIF4對(duì)PK活性的影響如圖3所示。

圖3 SIF4對(duì)丙酮酸激酶的影響Fig.3 The effect of SIF4 on PK

由圖3可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組PK活性均存在顯著差異(P<0.05)，1/2MIC、MIC和2MIC組，SIF4處理時(shí)間(x)與PK活性(y)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，量效線性方程為y=-0.002x+0.181 4(R2=0.846 5)、y=-0.000 3x+0.176 5(R2=0.736 6)和y=-0.005 8x+0.175 0(R2= 0.849 4)，特別是2MIC組，PK活性與處理時(shí)間呈良好線性關(guān)系，說明隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，SIF4對(duì)PK抑制活性呈增強(qiáng)趨勢(shì)。2MIC組處理4、8、12 h時(shí)，PK活性分別降至對(duì)照組的75.26%、69.29%和61.31%；PK為別構(gòu)酶，相對(duì)分子質(zhì)量為228 kDa，除需要二價(jià)金屬離子(Mg2+和Mn2+)外，還需一價(jià)金屬離子(K+，Rb+，Cs+)，特別是K+。SIF4對(duì)PK抑制作用可能是由于SIF4可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到PK別構(gòu)亞基中發(fā)揮別構(gòu)抑制效應(yīng)，SIF4結(jié)構(gòu)中Fe2+對(duì)PK可能存在潛在抑制活性[24]。

2.2 對(duì)TCA循環(huán)關(guān)鍵代謝酶的影響

2.2.1 對(duì)PDHC的影響

PDHC催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，反應(yīng)不可逆，是關(guān)鍵酶[25]。對(duì)PDHC影響如圖4所示。

圖4 SIF4對(duì)丙酮酸脫氫酶系的影響Fig.4 The effect of SIF4 on PDHC

由圖4可知，培養(yǎng)4 h時(shí)，1/2MIC組與對(duì)照組PDHC活性無差異顯著(P>0.05)，培養(yǎng)8～12 h時(shí)1/2MIC組與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)；MIC和2MIC組與對(duì)照組均有顯著差異(P<0.05)。PDHC為多酶復(fù)合體，由3種酶[丙酮酸脫氫酶(E1)、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰酶(E2)、二氫硫辛酸脫氫酶(E3)]和6種輔助因子共同組成，PDHC有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，E1催化的反應(yīng)最慢，催化的不可逆反應(yīng)控制整個(gè)反應(yīng)體系速率[25]。由于PDHC為多酶復(fù)合體，SIF4對(duì)PDHC的具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步確認(rèn)。

2.2.2 對(duì)CS的影響

CS能催化乙酰CoA與草酰乙酸縮合生成檸檬酸，是TCA循環(huán)第1個(gè)關(guān)鍵限速酶[26]。SIF4對(duì)CS的影響如圖5所示。

圖5 SIF4對(duì)檸檬酸合成酶的影響Fig.5 The effect of SIF4 on CS

由圖5可知，培養(yǎng)4 h時(shí)，1/2MIC與對(duì)照組CS無顯著差異(P>0.05)，8～12 h時(shí)有顯著性差異(P<0.05)，說明1/2MIC組存在時(shí)間依耐，需作用一定時(shí)間后對(duì)CS的抑制才表現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，而MIC、2MIC組均存在顯著差異(P<0.05)，說明金抗肽SIF4對(duì)CS的抑制存在時(shí)間或濃度依耐，低劑量組則需要處理一定時(shí)間后才表現(xiàn)良好的抑制活性，而高劑量組則在處理4 h就表現(xiàn)出顯著抑制效應(yīng)。因此，金抗肽SIF4應(yīng)用于大腸埃希菌抑菌時(shí)，可適當(dāng)將處理劑量提升到MIC或2MIC，以增強(qiáng)對(duì)食源性大腸埃希菌的抑制效果。

2.2.3 對(duì)IDH的影響

IDH能不可逆脫下異檸檬酸仲醇上的H而氧化為羰基并生成不穩(wěn)定性中間產(chǎn)物草酰琥珀酸，與酶結(jié)合后快速脫羧生成α-酮戊二酸、NADH和CO2，是第2個(gè)關(guān)鍵酶[27]。SIF4對(duì)IDH影響如圖6所示。

圖6 SIF4對(duì)異檸檬酸脫氫酶的影響Fig.6 The effect of SIF4 on IDH

由圖6可知，各試驗(yàn)組與對(duì)照組IDH活性均存在顯著差異(P<0.05)，但與處理劑量和處理時(shí)間有正相關(guān)關(guān)系，處理12 h時(shí)，1/2MIC、MIC和2MIC組IDH活性分別為對(duì)照組的94.20%、79.58%和73.08%，處理劑量與處理時(shí)間存在協(xié)同增強(qiáng)作用。IDH有NAD-依耐型異檸檬酸脫氫酶(NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase，NAD-IDH)和NADP-依耐型異檸檬酸脫氫酶(NADP-dependent isocitrate dehydrogenase，NADP-IDH)2種，催化產(chǎn)生的NADPH和NADH可起到抗氧化脅迫作用，有研究表明，IDH活性降低表明細(xì)胞受氧化應(yīng)激損傷越大，對(duì)不利環(huán)境耐受性降低[27]。

2.2.4 對(duì)α-KGDHC的影響

α-KGDHC催化α-酮戊二酸氧化脫羧反應(yīng)與PDHC催化機(jī)理相似，通過磷酸化/去磷酸化來調(diào)節(jié)復(fù)合酶系第一步反應(yīng)速率以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)催化效率的調(diào)控[28]，SIF4對(duì)α-KGDHC的影響如圖7所示。

圖7 SIF4對(duì)α-酮戊二酸脫氫酶系的影響Fig.7 The effect of SIF4 on α-KGDHC

由圖7可知，培養(yǎng)4 h時(shí)，1/2MIC組與對(duì)照組α-KGDHC 活性差異不顯著(P>0.05)，MIC和2MIC組與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，而培養(yǎng)8～12 h，各試驗(yàn)組與對(duì)照組α-KGDHC活性均存在顯著差異(P<0.05)；研究還發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組α-KGDHC活性隨處理劑量增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯降低趨勢(shì)，存在協(xié)同增效效應(yīng)[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)ROS體內(nèi)代謝受NADPH所提供質(zhì)子數(shù)量的影響，ROS積累會(huì)降低α-KGDH活性，過量ROS會(huì)引起菌體慢性缺氧，誘導(dǎo)菌體適應(yīng)性調(diào)節(jié)并使α-KGDH基因表達(dá)增強(qiáng)，α-KGDHC是ROS主要靶酶，對(duì)氧化應(yīng)激比較敏感，α-KGDH活性和細(xì)胞內(nèi)源ROS可作為潛在的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷重要的表征指標(biāo)[29]。

2.2.5 對(duì)糖有氧氧化代謝途徑抑制機(jī)理分析

以2MIC試驗(yàn)組為例，SIF4對(duì)大腸埃希菌糖代謝抑制活性如圖8所示，

a-EMP；b-TCA圖8 SIF4對(duì)糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響Fig.8 The effect of SIF4 on glucose metabolism

由圖8可知，EMP途徑中，SIF4對(duì)HK抑制效率最高(66.61%)，其次為PK(39.61%)，PFK抑制率最低(27.37%)，而TCA循環(huán)中，IDH抑制活性最高(26.99%，12 h)，處理8 h時(shí)α-KGDHC抑制率為23.44%，處理12 h時(shí)PDHC抑制率為25.20%，表明SIF4主要通過抑制糖酵解途徑中HK活性實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸埃希菌的抑菌。總體來說，SIF4對(duì)EMP途徑抑制效果要強(qiáng)于TCA循環(huán)，說明EMP途徑是SIF4對(duì)大腸埃希菌的主要糖代謝抑制途徑，EMP途徑和TCA循環(huán)中其他葡萄糖氧化代謝關(guān)鍵酶也受到不同程度抑制，說明SIF4對(duì)大腸埃希菌抑制是全方位多角度的，這也可能是金抗肽SIF4表現(xiàn)良好抑菌活性的重要原因[29]。

2.3 對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷的影響

2.3.1 對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化的影響

MDA是細(xì)胞質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化氧化損傷主要產(chǎn)物，MDA累積能加速氧化損傷，常作為細(xì)胞質(zhì)膜受損特征標(biāo)志物[30]。SIF4對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化損傷的影響如圖9所示。

圖9 SIF4對(duì)丙二醛含量的影響Fig.9 The effect of SIF4 on MDA content

由圖9可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組MDA含量均存在顯著差異(P<0.05)，對(duì)照組MDA均保持在較低水平且無顯著增加，說明對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷較少；研究發(fā)現(xiàn)，MDA含量與SIF4處理時(shí)間和劑量有關(guān)，同一處理劑量組間細(xì)胞質(zhì)膜受損程度隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增長(zhǎng)(P<0.05)，而同一處理時(shí)間組間細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷程度與處理劑量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，作用4、8、12 h，SIF4處理劑量(x)與MDA含量(y)有良好線性關(guān)系，分別為y=0.916 2x+0.159 6(R2=0.915 9)、y=1.248x+0.188(R2=0.893 9)和y=1.223 4x+0.241 8(R2=0.826 5)。有研究表明，微生物可改變細(xì)胞膜不飽和脂肪酸比例和含量來調(diào)整質(zhì)膜流動(dòng)性和抵御逆境，氧化應(yīng)激可影響細(xì)胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸比例和含量以及膜流動(dòng)性[31]，推測(cè)SIF4對(duì)大腸埃希菌抑菌活性可能與氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸比例、含量以及流動(dòng)性有關(guān)[29]，SIF4處理能增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷，當(dāng)大腸埃希菌細(xì)胞暴露在氧化應(yīng)激環(huán)境時(shí)，膜內(nèi)不飽和脂肪酸比例會(huì)明顯下滑，推斷細(xì)胞質(zhì)膜中不飽和脂肪酸是SIF4細(xì)胞質(zhì)膜損傷抑菌的重要效應(yīng)靶點(diǎn)之一，與DENICH等[31]一致。

2.3.2 對(duì)細(xì)胞內(nèi)源ROS生成的影響

細(xì)胞內(nèi)源ROS在信號(hào)傳導(dǎo)和維持菌體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用，低水平ROS能驅(qū)動(dòng)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激并刺激氧化應(yīng)激基因表達(dá)特定功能蛋白或保護(hù)或修復(fù)細(xì)胞損傷，但過量ROS可通過降解和變形細(xì)胞生物大分子而破壞菌體結(jié)構(gòu)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的初始因素[32]。DCFH-DA是一種本身無熒光的非標(biāo)記性的氧化敏感熒光探針，可自由穿梭進(jìn)入細(xì)胞并被胞內(nèi)酯酶水解生成DCFH，DCFH不能自由穿梭透過細(xì)胞膜而被裝載于胞內(nèi)，受胞內(nèi)ROS氧化可生成有綠色熒光二氯熒光素(dichlorofluorescein，DCF)，熒光強(qiáng)度與內(nèi)源ROS含量成正相關(guān)[33]。SIF4對(duì)細(xì)胞內(nèi)源ROS生成影響如圖10所示。

圖10 SIF4對(duì)細(xì)胞內(nèi)源ROS生成的影響Fig.10 The effect of SIF4 on endogenous ROS

由圖10可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組內(nèi)源ROS有顯著性差異(P<0.05)。1/2MIC、2MIC組培養(yǎng)4～12 h時(shí)組內(nèi)內(nèi)源ROS產(chǎn)生增幅無顯著性差異，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而MIC組在培養(yǎng)4～12 h時(shí)組間有顯著性差異，呈顯著遞增趨勢(shì)(P<0.05)，可能是由于1/2MIC組處理劑量太低，對(duì)菌體氧化應(yīng)激作用較弱，菌體氧化損傷應(yīng)答不明顯，而2MIC則可能是由于SIF4處理劑量較大，處理4 h時(shí)就已對(duì)菌體細(xì)胞質(zhì)膜造成較為明顯的氧化應(yīng)激損傷，隨后繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間，氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生的內(nèi)源ROS增幅并不明顯，表明菌體細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷已基本接近受損上限[34]，而MIC組胞內(nèi)ROS增長(zhǎng)與培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)有明顯關(guān)聯(lián)，可能與MIC組處理劑量適中，對(duì)菌體細(xì)胞質(zhì)膜的氧化損傷有時(shí)間依賴性，因此，菌體氧化應(yīng)激損傷程度隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)。有研究認(rèn)為，菌體細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS，造成氧化脅迫而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，并引發(fā)菌體細(xì)胞凋亡或程序性死亡[34]，而金抗肽SIF4對(duì)菌體細(xì)胞膜氧化損傷也可能是其重要的抑菌生化機(jī)制。

3 結(jié)論與討論

大腸埃希菌通過葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)并磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，經(jīng)EMP途徑和TCA循環(huán)完成葡萄糖的徹底氧化并生成ATP和中間代謝產(chǎn)物，EMP途徑和TCA循環(huán)是大腸埃希菌最重要的能量代謝途徑，是菌體生命活動(dòng)的能量基礎(chǔ)，大腸埃希菌作為典型的革蘭氏陰性食源性致病菌，系統(tǒng)研究金抗肽SIF4對(duì)其生物抑菌機(jī)理有助于理解金抗肽對(duì)其他食源性革蘭氏陰性菌的抑菌機(jī)理。研究表明，金抗肽SIF4主要通過抑制糖酵解途徑的已糖激酶這一關(guān)鍵酶實(shí)現(xiàn)抑菌，對(duì)三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶也有抑制活性，但對(duì)EMP途徑抑制效果要強(qiáng)于TCA循環(huán)；金抗肽SIF4對(duì)菌體細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷與處理劑量和處理時(shí)間有重要關(guān)聯(lián)，且存在協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷與胞內(nèi)ROS有密切關(guān)聯(lián)，而ROS生成與胞內(nèi)還原型輔酶提供的氫質(zhì)子數(shù)量有關(guān)[4]，解析葡萄糖生物氧化與細(xì)胞質(zhì)膜氧化應(yīng)激對(duì)菌體的影響是解析金抗肽SIF4對(duì)大腸埃希菌抑菌機(jī)理的重要途徑。HK、PFK和PK是EMP途徑催化不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而PDHC、CS、IDH和α-KGDHC是TCA循環(huán)途徑催化不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵酶，監(jiān)測(cè)金抗肽SIF4對(duì)糖有氧代謝關(guān)鍵酶活性可揭示金抗肽SIF4對(duì)大腸埃希菌的非細(xì)胞質(zhì)膜損傷機(jī)理；課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金抗肽SIF4可破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)表面疏水性并降低表面zeta電位，造成細(xì)胞聚沉，但對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷機(jī)理尚不清晰，試驗(yàn)研究了金抗肽SIF4處理對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷特性標(biāo)志物——MDA含量變化及胞內(nèi)ROS生成的影響機(jī)理，以期解析金抗肽SIF4基于細(xì)胞質(zhì)膜損傷的抑菌機(jī)理。通過研究基于細(xì)胞質(zhì)膜/非細(xì)胞質(zhì)膜損傷抑菌機(jī)理，為系統(tǒng)闡明金抗肽SIF4對(duì)大腸埃希菌的抑菌機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。下一步擬研究SIF4對(duì)菌體胞內(nèi)蛋白質(zhì)與核酸合成影響機(jī)理、與基因組DNA作用機(jī)制和對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶影響規(guī)律，可為闡明基于胞內(nèi)物質(zhì)代謝調(diào)控的非膜損傷抑菌機(jī)理提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。