沈子強，鄭璞，李睿英，吳丹，陳鵬程

(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

茉莉酸(3-氧-2-2′-順-戊烯基-環(huán)戊烷-1-乙酸)，及其衍生物統(tǒng)稱為茉莉素，茉莉素于第16屆國際植物生長會議被接受為一類新的植物激素[1]，屬于一類重要的脂質激素，在植物生物合成、代謝、信號轉導和響應生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[2]。茉莉素早期從素馨花的香精油中發(fā)現(xiàn)，被大量用在香水工業(yè)；之后人們在植物病原真菌的培養(yǎng)濾液中提取到茉莉酸，發(fā)現(xiàn)其對植物生長有調節(jié)作用。茉莉素在農業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)中有廣闊應用前景[3-4]，目前植物提取法和化學合成法制備茉莉酸都具有一定的局限性，難以滿足全球對茉莉酸類化合物的需求，因此微生物發(fā)酵產茉莉酸受到研究者的關注。

早在1968年有報道可可毛色二孢菌LasiodiplodiatheobromaeS22L靜態(tài)培養(yǎng)13 d，產約500 mg/L茉莉酸[5]。之后通過篩選新菌株、優(yōu)化發(fā)酵條件，L.theobromae715靜態(tài)發(fā)酵產茉莉酸可達到1 200 mg/L[6]；分離于向日葵的L.theobromae2334靜態(tài)發(fā)酵12 d可產1 250 mg/L茉莉酸[7]。然而DiplodiagossypinaATCC 10936在130 L發(fā)酵罐攪拌轉速150 r/min的條件下，茉莉酸產量只有146 mg/L[8]。靜態(tài)條件更有利于茉莉酸的生成，茉莉酸產量隨攪拌速率升高而降低[9-10]，這使得規(guī)模化發(fā)酵存在困難。目前茉莉酸的合成機制研究多集中于植物，對于真菌合成茉莉酸的研究較少。我們前期篩選到1株產茉莉酸的L.iranensisCCTCC M2017288[11]，本文通過比較菌株在靜態(tài)和振蕩2種培養(yǎng)條件下發(fā)酵的差異，基于非靶向代謝組學，闡釋發(fā)酵條件對菌株合成茉莉酸的影響，為真菌茉莉酸合成代謝機制、及優(yōu)化真菌發(fā)酵產茉莉酸工藝的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

伊朗毛色二孢菌(L.iranensisCCTCC M2017288)，分離于腐爛的玉蕊根，保藏于本實驗室。培養(yǎng)基同文獻[11]。

1.2 試劑與儀器

茉莉酸標準品，一飛生物科技有限公司；其他試劑均購自國藥試劑有限公司。

SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；PHS-3E自動pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；HYL-C恒溫搖床，太倉市強樂實驗設備有限公司；SPX-150-B恒溫生化培養(yǎng)箱，上海博泰實驗設備有限公司；S-10生物傳感器分析儀，深圳西爾曼科技有限公司；Waters2487高效液相色譜儀，美國waters公司；UHPLC-Q Exactive HF-X超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)方法

種子液制備：用接種鏟取1鏟(約1 cm3)PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的新鮮菌種接種至PDB培養(yǎng)基中，置搖床220 r/min、28 ℃培養(yǎng)48 h得到種子液，種子液按5%(體積分數(shù))接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

靜態(tài)培養(yǎng)：將裝有75 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱，靜態(tài)發(fā)酵9 d。分別于發(fā)酵第3、5、7、9天取樣用以參數(shù)分析。

振蕩培養(yǎng)：將裝有75 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶置于28 ℃恒溫搖床，搖床轉速為120 r/min，振蕩發(fā)酵9 d。取樣同上。

1.4 分析方法

發(fā)酵液參數(shù)分析：茉莉酸定量方法同文獻[12]；采用干重法測定每個錐形瓶中生物量；分別用生物傳感器分析儀和間苯二酚分光光度法測定發(fā)酵液中葡萄糖和果糖濃度；用pH計測定發(fā)酵液pH。

UPLC-MS/MS分析，儀器設置方法同文獻[13-14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(ANOVA；P<0.05)和t檢驗評估實驗中的統(tǒng)計學差異。利用OriginPro 2021繪制點線圖。原始質譜數(shù)據(jù)導入代謝組學處理軟件ProgenesisQI(WatersCorporation, Milford, USA)進行基線過濾、峰識別、積分等處理，其后采用該軟件進行特征峰搜庫鑒定，將MS和MS/MS質譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配，MS質量誤差設置為<10-6，同時根據(jù)二級質譜匹配得分鑒定代謝物。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)、聚類分析及熱圖繪制均借助R語言完成[15]。

2 結果與分析

2.1 靜態(tài)與振蕩培養(yǎng)對L.iranensis發(fā)酵產茉莉酸的影響

在發(fā)酵過程中，觀察到2種條件下菌體外形差異顯著。靜態(tài)培養(yǎng)條件下，L.iranensis于發(fā)酵第3天在發(fā)酵液表面形成一層白色的菌膜；隨后，菌膜增長至一定厚度后基本不再變化，內部顏色向黃褐色轉變。振蕩培養(yǎng)條件下，菌體呈現(xiàn)出白色、團狀(圖1)。跟蹤測定2種培養(yǎng)條件下的發(fā)酵參數(shù)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液茉莉酸濃度差異顯著(圖2-a)：靜態(tài)條件下，茉莉酸濃度于第3～5天快速升高，隨后緩慢升高至800.91 mg/L，7 d后開始少量減??；而振蕩條件下茉莉酸濃度緩慢升高，發(fā)酵9 d僅152.09 mg/L。振蕩條件下，菌體生物量的增長快于靜態(tài)，發(fā)酵3 d達到10.00 g/L，而靜態(tài)培養(yǎng)僅為5.13 g/L。培養(yǎng)5 d后，兩者的差距減少但前者始終大于后者(圖2-b)。振蕩培養(yǎng)的糖消耗速率更快，培養(yǎng)3 d總糖幾乎被耗盡，而靜態(tài)培養(yǎng)7 d總糖才被耗盡(圖2-c)。兩者的發(fā)酵液pH變化也不同，初始pH相同為5.48，培養(yǎng)3 d后振蕩培養(yǎng)的pH在6.50上下波動，而靜態(tài)培養(yǎng)中pH逐漸從5.37 升高至7.96(圖2-d)。這些參數(shù)變化的差異說明菌株在2種培養(yǎng)條件下的代謝特征不同。

圖1 L.iranensis在靜態(tài)與振蕩培養(yǎng)下的外觀差異Fig.1 The appearance difference of L.iranensis under static and shaking culture

L.iranensis在振蕩條件下茉莉酸產量遠低于靜態(tài)條件，這一現(xiàn)象與DHANDHUKIA等[9]和ENG等[10]的報道一致。靜態(tài)環(huán)境更有利于某些真菌的代謝活性物質合成，這種現(xiàn)象在靈芝Ganodermalucidum中也存在。如G.lucicumCGMCC5.616在液體靜態(tài)培養(yǎng)下單體靈芝酸的含量是振蕩培養(yǎng)下的6～25倍[16]；液體淺層靜態(tài)培養(yǎng)G.lucidumCGMCC5.26產靈芝三萜的產量是搖瓶培養(yǎng)的2.10倍[17]。為解析靜態(tài)條件下目標化合物的高產機制，組學技術是常用的手段。

2.2 差異代謝物的篩選與分析

采用非靶向代謝組學手段，鑒定兩者發(fā)酵過程中4個時間點(3、5、7、9 d)發(fā)酵液中代謝物并分析其變化規(guī)律。共檢測到1 484個代謝物，為了實現(xiàn)高水平的組間分離和鑒別出引入差異的代謝物，對2種條件下代謝物進行了有監(jiān)督的OPLS-DA。得到的R2Y和Q2Y分別是0.997和0.862，表明模型擬合度良好。進一步采用置換檢驗來驗證模型的預測能力和魯棒性，經過200次排列，得到的R2和Q2值分別是0.71和-0.20(圖3-a)，模型的Q2為-0.20表明模型可靠。根據(jù)t檢驗得到的P值、OPLS-DA模型計算出的變量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值和代謝物濃度倍數(shù)值(fold change,FC)(代謝物靜態(tài)條件下相對濃度/振蕩條件下相對濃度，4個時間點平均值)，繪制火山圖以展示代謝物豐度差異(圖3-b)。

a-茉莉酸質量濃度；b-生物量；c-總糖；d-發(fā)酵液pH圖2 靜態(tài)和振蕩條件下的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve under static and shaking culture

a-置換檢驗；b-代謝物的豐度差異火山圖圖3 靜態(tài)和振蕩條件下代謝物的多元統(tǒng)計分析Fig.3 Multivariate statistical analysis of metabolites under static and shaking culture

采用普遍接受的標準即VIP>1和P<0.05[18-19]，篩選出2種發(fā)酵條件下的共77個差異代謝物。取代謝物豐度log轉化值并繪制差異代謝物聚類熱圖(圖4)，可以直觀地看出各差異代謝物相對濃度隨發(fā)酵時間變化趨勢。

聚類分析將差異代謝物表達模式細分為5小類(聚類樹左側顏色)，可概括為兩大類。其中一類是靜態(tài)條件相較于振蕩條件下調，即代謝物相對濃度前者低于后者，共有48個代謝物。這48個下調代謝物中，20個富集到了KEGG代謝途徑，如表1所示。下調差異代謝物數(shù)量最多的代謝途徑是氨基酸代謝，其次是核苷酸代謝。其中半乳糖醇、2-(4-羥基苯基)乙醇、S-腺苷-L-高半胱氨酸、甲基丙二酸、鳥苷、腺嘌呤、膽堿甘油磷酸、L-色氨酸、(3S,4R,5S,6S)-6-甲氧烷-2,3,4,5-醇、L-酪氨酸、苯乙烯、亞精胺、L-苯丙氨酸和4-(2-氨基苯基)-2,4-二氧代丁酸下調較顯著。另一類上調共29個代謝物是靜態(tài)條件下相對濃度更高，有6個富集到了KEGG代謝途徑，如表2所示。其中茉莉酸、N-乙酰-D-半乳糖胺上調顯著。

在振蕩條件下，菌體氨基酸代謝非?；钴S，并且嘌呤類物質濃度更高。氨基酸代謝在細胞內的代謝流向主要是兩個方面，一是合成機體自身所需的蛋白質、多肽及其他含氮物質，二是分解成α-酮酸、胺類及二氧化碳。α-酮酸可以轉變成糖、脂類或再合成某些非必需氨基酸，也可以經過三羧酸循環(huán)氧化釋放能量。菌體生長繁殖及維持代謝活動離不開蛋白質和能量，嘌呤類物質是遺傳物質的組成成分。振蕩條件下，菌體攝取的營養(yǎng)物質更多地流向這些初級代謝途徑，這可能影響茉莉酸合成前體物質的積累，造成流向茉莉酸合成這一次級代謝途徑[7]的通量減少。

圖4 差異代謝物相對濃度變化熱圖Fig.4 Heatmap of change in the relative concentration of differential metabolites

2.3 脂質代謝途徑的差異

差異代謝物中共有2個化合物匹配到脂質代謝途徑，分別是9(S)-羥基十八碳二烯酸和茉莉酸。通過KEGG富集分析，9(S)-羥基十八碳二烯酸屬于亞油酸代謝途徑(Ko00591)，而茉莉酸屬于α-亞麻酸代謝途徑(Ko00592)。對這2條代謝途徑中檢測到的所有化合物進行時間維度上的比較，用不同顏色表示代謝物靜態(tài)條件與振蕩條件下豐度的比值，如圖5所示。在2種培養(yǎng)條件下，菌體亞油酸代謝和α-亞麻酸代謝存在明顯差異。在α-亞麻酸代謝中，靜態(tài)條件下茉莉酸相對含量高，而代謝支路3-己烯醇和愈傷酸含量相對低。而亞油酸代謝中，靜態(tài)條件下9(S)-羥基十八碳二烯酸、13(S)-氫過氧十八碳二烯酸和9,10,13-三羥基十八碳烯酸的相對含量總體偏低。

在植物中α-亞麻酸經脂氧合酶催化轉變?yōu)?3-氫過氧亞麻酸[13(S)-hydroperoxyoctadec-atrienoic acid，13-HPOT]，13-HPOT經丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase，AOS)和丙二烯氧化物環(huán)化酶(allene oxide cyclase，AOC)兩步反應變?yōu)?2-氧-植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic acid，OPDA)，OPDA經一次還原反應和三輪β-氧化轉變?yōu)檐岳蛩醄20]。

表1 下調差異代謝物的具體信息Table 1 Specific information of down-regulated differential metabolites

表2 上調差異代謝物的具體信息Table 2 Specific information of up-regulated differential metabolites

我們在真菌發(fā)酵液中檢測到同屬于該代謝途徑的愈傷酸和3-己烯醇。根據(jù)圖5-b，愈傷酸、3-己烯醇與茉莉酸競爭前體13-HPOT，是茉莉酸合成的副產物。相較于振蕩條件，靜態(tài)條件下流向茉莉酸的通量在發(fā)酵周期內占據(jù)優(yōu)勢，流向愈傷酸和3-己烯醇的通量在發(fā)酵后期處于劣勢。

a-亞油酸代謝途徑；b-α-亞麻酸代謝途徑圖5 脂質代謝途徑局部圖Fig.5 Partial diagram of lipid metabolism

3 結論

本研究通過靜態(tài)與振蕩條件下的發(fā)酵實驗，比較了L.iranensis產茉莉酸過程參數(shù)以及代謝譜的差異。通過對發(fā)酵參數(shù)追蹤分析，發(fā)現(xiàn)振蕩環(huán)境顯著改變了L.iranensis的代謝特征，且振蕩環(huán)境不利于茉莉酸的產生。代謝組學分析共鑒定出77個差異代謝物，其中48個下調，29個上調。振蕩條件下，菌體攝取的營養(yǎng)物質更多地流向氨基酸代謝和核苷酸代謝，而流向茉莉酸合成的通量相對減少，且茉莉酸合成中間體還被愈傷酸、3-己烯醇支路競爭，這可能是其茉莉酸產量低的原因?？刂瓢l(fā)酵過程菌體的生長，減少代謝支路通量，可能是提高真菌在振蕩條件下茉莉酸產量的有效策略。