卞金玉，張曉梅*，徐國強(qiáng)，史勁松，許正宏

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(糧食與發(fā)酵國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

L-半胱氨酸(L-cysteine)是一種重要的含硫化合物，屬于非必需氨基酸，在大多數(shù)生物中，L-半胱氨酸是細(xì)胞代謝所需還原硫的唯一來源[1]。L-半胱氨酸除了參與細(xì)胞代謝外，在醫(yī)藥，食品和化妝品行業(yè)也有重要作用[2-4]。目前主要通過提取法和化學(xué)合成法生產(chǎn)L-半胱氨酸[5-7]。然而，這些方法存在過程復(fù)雜、產(chǎn)率低等問題[8]。微生物發(fā)酵法具有綠色、安全和環(huán)保等優(yōu)點[9]，其經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益也受到越來越多研究者的關(guān)注。目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸的研究主要集中于大腸桿菌(Escherichiacoli)，文獻(xiàn)報道大腸桿菌生產(chǎn)L-半胱氨酸的最高產(chǎn)量為8.34 g/L[10]。與大腸桿菌相比，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)不產(chǎn)內(nèi)毒素，是食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)可的生產(chǎn)食品和藥品安全的(Generally Recognized as Safe，GRAS)微生物[11]，但谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-半胱氨酸的研究相對較少[12-14]。

在谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌中，合成L-半胱氨酸的前體均為L-絲氨酸。與大腸桿菌不同的是谷氨酸棒桿菌具有直接的硫化途徑，而不是通過生物合成L-甲硫氨酸的轉(zhuǎn)硫途徑[15]。L-半胱氨酸的合成代謝途徑如圖1所示，前體L-絲氨酸在L-絲氨酸O-乙?；D(zhuǎn)移酶(L-serineO-acetyltransferase，SAT，編碼基因cysE)催化下生成O-乙?；?L-絲氨酸(O-acetyl-L-serine，OAS)，然后在OAS巰基化酶-A(OAS sulfhydrylase-A,OASS-A，編碼基因cysK)催化下得到L-半胱氨酸。SAT的酶活力受到L-半胱氨酸的反饋抑制，該反應(yīng)也是L-半胱氨酸合成的關(guān)鍵限速步驟[16-17]。目前在谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌中主要采用以下策略提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量[18-20]：(1)增強(qiáng)L-半胱氨酸生物合成；(2)弱化L-半胱氨酸降解途徑；(3)加強(qiáng)表達(dá)L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。WEI等[18]利用代謝工程策略構(gòu)建了產(chǎn)L-半胱氨酸的谷氨酸棒桿菌，L-半胱氨酸產(chǎn)量為947.9 mg/L，是目前報道的谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-半胱氨酸的最高產(chǎn)量；然而仍存在產(chǎn)量較低的問題，推測前體L-絲氨酸水平可能是限制L-半胱氨酸生物合成的重要因素。

本課題組前期通過代謝工程改造獲得了一株產(chǎn)L-絲氨酸30.57 g/L的谷氨酸棒桿菌A36[21]，本文以高產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌A36為出發(fā)菌株，通過加強(qiáng)表達(dá)L-半胱氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶，敲除L-半胱氨酸降解途徑關(guān)鍵酶弱化L-半胱氨酸的降解，強(qiáng)化L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)以及優(yōu)化硫源這4個策略來提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量，為L-半胱氨酸高效生物合成奠定基礎(chǔ)。

圖1 L-半胱氨酸在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的生物合成途徑Fig.1 L-cysteine biosynthesis pathway in Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum注：紅色虛線表示本研究中執(zhí)行的代謝工程步驟； 紅色“X”表示目標(biāo)基因的缺失；紅色五星表示反饋抑制的脫敏

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒以及主要試劑

本文所用菌株與質(zhì)粒如表1所示。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；EcoR I、XbaI和Hind Ⅲ等限制性內(nèi)切核酸酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。其他試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 本文涉及的相關(guān)菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10(固體培養(yǎng)基，瓊脂粉20)。

種子培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸液37，葡萄糖20，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.2，NaH2PO40.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 50，玉米漿 25，(NH4)2SO415，KH2PO40.8，K2HPO41.2，MgSO40.5，MnSO40.01，F(xiàn)eSO40.01，維生素B11，維生素B66，生物素0.2，CaCO320。發(fā)酵罐培養(yǎng)基采用氨水和磷酸替換CaCO3。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

組成型加強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：質(zhì)粒pDXW-10是大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌穿梭型質(zhì)粒，為組成型表達(dá)質(zhì)粒，可用于外源基因的高效表達(dá)，其攜帶tacM強(qiáng)啟動子與Kan抗性標(biāo)記。以加強(qiáng)表達(dá)cysEFr為例，由天霖生物科技(上海)有限公司合成cysEFr基因，cysEFr分別為來自大腸桿菌MG1655的解除反饋抑制的EccysEFr(M201R)以及來自擬南芥的AtcysEFr，目的基因經(jīng)EcoR I和BglⅡ雙酶切后與線性化的質(zhì)粒pDXW-10連接，構(gòu)建組成型加強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒。

敲除質(zhì)粒的構(gòu)建：aecD基因利用敲除質(zhì)粒pK 18 mobsacB-ΔaecD進(jìn)行敲除。以A36基因組為模板，利用同源重組軟件設(shè)計引物aecD-1/aecD-2和aecD-3/aecD-4，擴(kuò)增上下游片段。采用EcoR I和XbaI雙酶切敲除質(zhì)粒pK 18 mobsacB，再將上下游同源片段與線性化質(zhì)粒pK 18 mobsacB連接，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pK 18 mobsacB-ΔaecD。

1.2.2 發(fā)酵方法

搖瓶發(fā)酵：吸取適量菌液，于種子平板上三區(qū)劃線，30 ℃培養(yǎng)3 d，然后挑取單菌落在平板上密集劃線，培養(yǎng)3 d。刮取1環(huán)菌落接種至20 mL種子液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h。待種子液OD562=20～25，按照4%的接種量接種至25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min 往復(fù)式搖床培養(yǎng)48 h，每隔12 h取樣，測定生物量及L-半胱氨酸產(chǎn)量。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：取6 mL種子液接種至100 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min往復(fù)式搖床培養(yǎng)24 h，待種子液OD562值到達(dá)對數(shù)生長期，以10%的接種量接種至發(fā)酵罐中，在發(fā)酵24 h時添加12 g/L的Na2S2O3。在發(fā)酵過程中，采用50%氨水和50%磷酸調(diào)節(jié)pH，使pH保持在7左右，通過自動調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量使溶氧(dissolved oxygen，DO)控制在10%左右，每隔12 h取樣，測定生物量及L-半胱氨酸產(chǎn)量。

1.2.3 分析方法

生物量的測定：采用紫外分光光度計測定。首先將發(fā)酵液振蕩混勻，吸取適量發(fā)酵液，加入1 mol/L鹽酸溶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，利用紫外分光光度計于562nm處測定生物量。

L-半胱氨酸的測定：采用HPLC方法測定發(fā)酵液中L-半胱氨酸的含量[22]。

糖的測定：采用西爾曼生物傳感器測定發(fā)酵液中糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 強(qiáng)化合成途徑對L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響

2.1.1 強(qiáng)化合成途徑重組菌株的構(gòu)建

由于SAT是谷氨酸棒桿菌合成L-半胱氨酸重要的限速酶，該酶受到產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸的反饋抑制；如要提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量，就需解除L-半胱氨酸引起的反饋抑制。目前主要采用以下兩種方法獲得對反饋抑制不敏感的SAT：(1)通過定點誘變或隨機(jī)誘變改造SAT；(2)利用高等植物中對反饋抑制不敏感的天然SAT。因此本文選擇來自大腸桿菌的cysEFr(M201R)，降低L-半胱氨酸反饋抑制的敏感性，使其在谷氨酸棒桿菌中外源表達(dá)。另外選擇來自擬南芥對反饋抑制不敏感的天然SAT在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行外源表達(dá)。采用1.2.1 方法構(gòu)建組成型加強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒，選擇不同來源的L-半胱氨酸關(guān)鍵酶cysEFr(大腸桿菌EccysEFr和擬南芥AtcysEFr)，將目的片段與質(zhì)粒pDXW-10相連接，構(gòu)建了質(zhì)粒pDXW-10-EccysEFr和pDXW-10-AtcysEFr。

在谷氨酸棒桿菌中，OAS在由cysK編碼的OAS巰基化酶-A的催化作用下生成L-半胱氨酸，這是L-半胱氨酸合成途徑的第二個關(guān)鍵酶，因此在加強(qiáng)表達(dá)cysEFr的質(zhì)粒 pDXW-10-EccysEFr和pDXW-10-AtcysEFr中分別串聯(lián)表達(dá)來源出發(fā)菌株A36中的cysK，構(gòu)建了質(zhì)粒pDXW-10-EccysEFr-cysK和pDXW-10-AtcysEFr-cysK。將質(zhì)粒pDXW-10-EccysEFr、pDXW-10-AtcysEFr、pDXW-10-EccysEFr-cysK和pDXW-10-AtcysEFr-cysK電轉(zhuǎn)化A36感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子，PCR驗證質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，驗證結(jié)果如圖2-a所示，EccysEFr和AtcysEFr基因長度分別為822 bp和945 bp，cysK基因長度為936 bp，PCR條帶大小相符；經(jīng)測序驗證序列正確無突變，表明重組菌株S-C-1、S-C-2、S-C-3和S-C-4構(gòu)建成功。

2.1.2 強(qiáng)化合成途徑重組菌株的發(fā)酵評價

重組菌株的發(fā)酵結(jié)果如圖2-b所示，S-C-1和S-C-2菌株分別產(chǎn)115.8 mg/L和105.8 mg/L，而出發(fā)菌株A36不產(chǎn)L-半胱氨酸。菌株S-C-3和S-C-4L-半胱氨酸的產(chǎn)量分別為95.2 mg/L和36.5 mg/L，與僅表達(dá)L-半胱氨酸關(guān)鍵酶cysEFr的菌株S-C-1和S-C-2菌株相比，L-半胱氨酸產(chǎn)量分別下降17.8%和65.5%，說明串聯(lián)表達(dá)cysK并不利于L-半胱氨酸的積累，推測宿主菌株中cysK編碼的OASS-A具有一定活性，自身可以維持L-半胱氨酸合成途徑暢通，加強(qiáng)表達(dá)反而增加菌株負(fù)擔(dān)，不利于重組菌株產(chǎn)L-半胱氨酸。由于加強(qiáng)表達(dá)cysK不利于L-半胱氨酸的積累，因此后續(xù)研究在菌株S-C-1和S-C-2中進(jìn)行。

M-DNA Marker；1-原始菌株的PCR產(chǎn)物；2、3-cysEFr基因的PCR產(chǎn)物； 4、5-cysEFr-cysK基因的PCR產(chǎn)物；6、7-cysEFr-bcr基因的PCR產(chǎn)物 a-菌株S-C-1、S-C-2、S-C-3、S-C-4、S-C-5、S-C-6的PCR驗證電泳圖譜； b-菌株A36、S-C-1、S-C-2、S-C-3、S-C-4的發(fā)酵結(jié)果圖2 加強(qiáng)表達(dá)合成途徑對L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響Fig.2 The effect of enhanced expression synthesis pathway on L-cysteine production

2.2 強(qiáng)化轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響

2.2.1 強(qiáng)化轉(zhuǎn)運(yùn)途徑重組菌株的構(gòu)建

胞內(nèi)積累過多的L-半胱氨酸會對菌株產(chǎn)生毒性，強(qiáng)化L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以促進(jìn)產(chǎn)物外排，減少L-半胱氨酸對X菌株的毒性，從而提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量。因此在S-C-1(加強(qiáng)表達(dá)EccysEFr)和S-C-2(加強(qiáng)表達(dá)AtcysEFr)兩個重組菌株中串聯(lián)表達(dá)L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bcr，構(gòu)建了重組菌株S-C-5和S-C-6。菌株構(gòu)建的驗證結(jié)果如圖2-a所示，bcr基因長度為1 194 bp，條帶大小相符；經(jīng)測序驗證序列正確，表明重組菌株S-C-5和S-C-6構(gòu)建成功。

2.2.2 強(qiáng)化轉(zhuǎn)運(yùn)途徑重組菌株的發(fā)酵評價

重組菌株S-C-5和S-C-6的發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，重組菌S-C-5和S-C-6L-半胱氨酸產(chǎn)量分別為253.3 mg/L和216.7 mg/L，與菌株S-C-1和S-C-2相比分別提高了1.2倍和1.0倍。結(jié)果表明，加強(qiáng)表達(dá)L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)可以將更多的L-半胱氨酸運(yùn)輸出胞外，顯著提高谷氨酸棒桿菌L-半胱氨酸的產(chǎn)量。

圖3 菌株S-C-5和S-C-6的發(fā)酵結(jié)果Fig.3 The fermentation of strain S-C-5 and S-C-6

2.3 弱化降解途徑對L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響

2.3.1 弱化降解途徑重組菌株的構(gòu)建

弱化產(chǎn)物降解是進(jìn)一步提高氨基酸產(chǎn)量的有效方法。L-半胱氨酸的降解主要由L-半胱氨酸脫硫酶(cysteine desulfurase，CD)催化。本文在加強(qiáng)表達(dá)合成途徑的菌株S-C-1，S-C-2基礎(chǔ)上敲除aecD弱化L-半胱氨酸降解。采用1.2.1中的方法構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒pK 18 mobsacB-ΔaecD，將構(gòu)建質(zhì)粒pK 18 mobsacB-ΔaecD電轉(zhuǎn)到A36感受態(tài)細(xì)胞中，在含Kan的平板上涂布，進(jìn)行一次同源重組，然后挑選正確的轉(zhuǎn)化子涂布于10%的蔗糖培養(yǎng)基進(jìn)行二次重組，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，驗證如圖4-a所示，出發(fā)菌株的條帶大小約2 000 bp左右，敲除重組菌株的條帶大小為1 000 bp左右，表明敲除菌株A36-ΔaecD構(gòu)建成功。將質(zhì)粒pDXW-10-EccysEFr、pDXW-10-AtcysEFr、pDXW-10-EccysEFr-bcr和pDXW-10-AtcysEFr-bcr電轉(zhuǎn)化A36-ΔaecD感受態(tài)細(xì)胞，于30 ℃培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR驗證，驗證結(jié)果如圖4-b所示，表明重組菌株S-C-7、S-C-8、S-C-9和S-C-10構(gòu)建成功。

2.3.2 弱化降解途徑重組菌株的發(fā)酵評價

重組菌株的發(fā)酵結(jié)果如圖4-c所示，與S-C-1(115.8 mg/L)和S-C-2(105.8 mg/L)相比，菌株S-C-7和S-C-8L-半胱氨酸的產(chǎn)量分別提高了1.5倍和1.0倍，說明敲除基因aecD后，可以使更多的碳流流向產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸。與S-C-7(286.7 mg/L)和S-C-8(236.7 mg/L)相比，菌株S-C-9和S-C-10的L-半胱氨酸產(chǎn)量并沒有提高，甚至S-C-9還下降29.1%，這與WEI等[18]通過代謝改造構(gòu)建的菌株CYS-13不同，強(qiáng)化L-半胱氨酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)同時減少其降解并沒有進(jìn)一步提高L-半胱氨酸產(chǎn)量，分析原因可能是采用的底盤細(xì)胞不同，文獻(xiàn)中采用的底盤細(xì)胞為谷氨酸棒桿菌ATCC13032，本文采用的是一株高產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌A36，底盤細(xì)胞對L-半胱氨酸的耐受能力存在差異。為進(jìn)一步提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量，選擇構(gòu)建的重組菌株中產(chǎn)量最高的S-C-7(圖5)進(jìn)行硫源的優(yōu)化。

M-DNA Marker；1-A36原始菌的PCR產(chǎn)物；2、6-敲除成功aecD 基因后的PCR產(chǎn)物；3～5-未敲除成功aecD基因后的PCR產(chǎn)物； 7、8-cysEFr基因的PCR產(chǎn)物；9、10-cysEFr-bcr基因的PCR產(chǎn)物 a-aecD基因敲除后的PCR驗證電泳圖譜；b-菌株S-C-7、S-C-8、S-C-9、 S-C-10的PCR驗證電泳圖譜；c-菌株S-C-7、S-C-8、S-C-9、S-C-10 的發(fā)酵結(jié)果圖4 弱化降解途徑對L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響Fig.4 The effect of weakening degradation pathway on L-cysteine production

2.4 硫源對重組菌株發(fā)酵的影響

2.4.1 不同硫源對重組菌株發(fā)酵的影響

L-半胱氨酸是含硫氨基酸，硫源的供給對提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量至關(guān)重要。首先考察不同的硫源對L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響，分別外源添加10 g/L的Na2S2O3、Na2S、Na2SO4和NaHS，以不添加硫源作為對照，發(fā)酵結(jié)果如圖6-a所示，添加不同的硫源均會影響重組菌株的生長和產(chǎn)L-半胱氨酸，其中添加Na2S和NaHS導(dǎo)致重組菌株不再生長。添加Na2S2O3和Na2SO4會在一定程度上抑制重組菌株生長，與對照相比，生物量分別下降18.1%和23.6%，同時L-半胱氨酸的產(chǎn)量均有提高，當(dāng)以Na2S2O3為硫源時，L-半胱氨酸產(chǎn)量最高，為461.5 mg/L，因此后續(xù)選擇Na2S2O3作為硫源。

圖5 本文構(gòu)建的重組菌株L-半胱氨酸的產(chǎn)量Fig.5 The production of L-cysteine of the recombinant strain constructed

2.4.2 不同濃度 Na2S2O3對重組菌株發(fā)酵的影響

進(jìn)一步考察Na2S2O3質(zhì)量濃度(4、6、8、10、12、14、20、30 g/L)對重組菌株生長及產(chǎn)L-半胱氨酸的影響，結(jié)果如圖6-b所示，隨著Na2S2O3濃度的增加，L-半胱氨酸產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)Na2S2O3質(zhì)量濃度為12 g/L，L-半胱氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大，為476.0 mg/L，此后再提高Na2S2O3的濃度，L-半胱氨酸產(chǎn)量不再變化，故選擇12 g/L 作為Na2S2O3的最佳濃度。

2.4.3 不同時間添加Na2S2O3對重組菌株發(fā)酵的影響

考察不同時間(0、12、24、36 h)添加Na2S2O3對重組菌株生長及產(chǎn)L-半胱氨酸的影響，結(jié)果如圖6-c所示，在第24 h時添加Na2S2O3，L-半胱氨酸產(chǎn)量達(dá)到581.6 mg/L，相對于0 h 添加Na2S2O3，提高了22.2%，說明在菌株生長24 h 時再添加Na2S2O3對重組菌株生長抑制減弱。

a-不同硫源對S-C-7發(fā)酵的影響；b-不同濃度Na2S2O3對S-C-7發(fā)酵的影響；c-不同時間添加Na2S2O3對S-C-7發(fā)酵的影響圖6 優(yōu)化硫源對S-C-7發(fā)酵的影響Fig.6 The effect of optimizing sulfur source on S-C-7 fermentation

2.5 重組菌株5 L發(fā)酵罐發(fā)酵評價

進(jìn)一步考察重組菌株S-C-7在5 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵性能，從圖7可以看出，發(fā)酵48 hL-半胱氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高，為1.2 g/L，在發(fā)酵48 h時發(fā)酵液中糖基本消耗完全。與搖瓶條件下的最高產(chǎn)量相比，菌株S-C-7在5 L發(fā)酵罐上L-半胱氨酸的產(chǎn)量提高了1.1倍。我們進(jìn)一步研究顯示，在搖瓶條件下，當(dāng)L-半胱氨酸超過0.5 g/L，即對A36菌株產(chǎn)生毒性(數(shù)據(jù)未展示)，后續(xù)可以考慮采用適應(yīng)性進(jìn)化來提高底盤細(xì)胞A36對L-半胱氨酸的耐受性，從而進(jìn)一步提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量。

圖7 重組菌株S-C-7在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程曲線Fig.7 The fermentation curve of recombinant strain S-C-7 in 5 L bioreactor

3 結(jié)論

本文以實驗室保藏的一株高產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌A36為出發(fā)菌株，通過解除L-半胱氨酸對cysE的反饋抑制，增強(qiáng)L-絲氨酸O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶和OAS巰基化酶-A的表達(dá)，強(qiáng)化L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，并且弱化了L-半胱氨酸的降解，成功構(gòu)建產(chǎn)L-半胱氨酸的重組菌株；其中菌株S-C-7的L-半胱氨酸產(chǎn)量最高，為286.7 mg/L；進(jìn)一步對重組菌株S-C-7進(jìn)行硫源的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵24 h時添加12 g/L的Na2S2O3，菌株S-C-7的L-半胱氨酸達(dá)到581.6 mg/L，較優(yōu)化前提高了1.0倍。最后在5 L發(fā)酵罐對菌株S-C-7進(jìn)行發(fā)酵評價，L-半胱氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.2 g/L，是目前報道的谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-半胱氨酸的最高產(chǎn)量。