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        冠狀動脈擴張患者淋巴細胞和單核細胞亞型分析

        2022-11-01 10:30:16劉銳鋒盛倩倩趙慧強
        內(nèi)科理論與實踐 2022年5期
        關鍵詞:差異研究

        劉銳鋒, 盛倩倩, 張 悅, 趙慧強

        (首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院心內(nèi)科,北京 100050)

        冠狀動脈(冠脈)擴張(coronary artery ectasia,CAE)定義為冠脈直徑超過正?;蛘呦噜弰用}段直徑的1.5倍以上[1]。大多數(shù)CAE病例是通過冠脈造影等影像學檢查診斷。接受冠脈造影評估的患者有1.2%~7.4%被診斷為CAE[2]。超過90%的CAE患者合并有冠心?。╟oronary heart disease,CHD),表現(xiàn)為冠脈粥樣硬化改變,包括斑塊負荷、脂質沉積和冠脈中層膽固醇結晶[1,3]。CAE的病因和發(fā)病機制尚不清楚,目前認為CAE是一種炎癥性疾病,因為CAE患者表現(xiàn)為外周血細胞炎癥因子失衡和冠脈壁大量炎癥細胞浸潤[3-5]。此外CAE患者冠脈中間層的平滑肌和彈性纖維層有明顯的破壞,這種改變與免疫系統(tǒng)紊亂相關血管炎的病理變化相似[1]。因此,了解CAE是否伴隨免疫系統(tǒng)紊亂很重要,關系到CAE患者的病因探討和是否可能應用免疫相關治療。因此,本研究擬通過檢測CAE患者的外周淋巴細胞和單核細胞亞型來初步回答,CAE是否同時存在炎癥和免疫系統(tǒng)異常。外周血淋巴細胞分為以下亞型:T淋巴細胞(CD3+)、B淋巴細胞(CD19+)和自然殺傷(natural killer,NK)淋巴細胞(CD3-CD16+和CD56+或CD56+);T細胞進一步分為輔助性T細胞2群(CD3+CD4+)和輔助性T細胞1群(CD3+CD8+)[6]。根據(jù)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共受體(CD14)和FcγRⅢ受體(CD16)的表達,單核細胞被分為經(jīng)典型(CD14++CD16-)、中間型(CD14++CD16+)和非經(jīng)典型(CD14+CD16++)3種亞型[7]。本研究通過流式細胞儀來進行檢測和分類。

        對象和方法

        一、研究對象

        2017年1月至2018年1月,共有2 506例患者在北京友誼醫(yī)院心導管中心接受冠脈造影檢查,56例(2.23%)確診患有CAE。連續(xù)12個月,按照每例CAE患者接受冠脈造影和確診的日期,采用抽簽法隨機選擇在同一日期內(nèi)接受冠脈造影的CHD患者和冠脈相對正常的受試者(對照),保持年齡、性別、高血壓、吸煙史、血脂、飲酒、肝功能、腎功能等基線資料基本平衡。本研究根據(jù)納入和排除標準初步納入其中34例CAE患者,同日期與之匹配的有30例CHD患者和32例對照人群。冠脈造影結束后,立即采集外周血液并進行流式細胞檢測。該研究經(jīng)北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準,并根據(jù)《赫爾辛基宣言》進行,已獲得了所有參與者的知情同意。對CAE、CHD和對照組之間的基線數(shù)據(jù)、關鍵的實驗室檢測和冠脈造影特征進行全面的比較和分析。

        1.納入標準:CAE被定義為冠脈直徑超過相鄰的正常冠脈段的1.5倍[1]。根據(jù)目前的共識,CHD被定義為1個或多個主要冠脈存在≥50%狹窄,將狹窄≤20%且無其他冠脈異常的受試者作為對照[8]。

        2.排除標準:懷孕或患有急性冠脈綜合征、心肌病、心肌炎、瓣膜心臟病、心力衰竭、其他血管動脈瘤、此前確診為膠原組織疾病和血管炎疾病、梅毒、明確診斷的肺栓塞和主動脈夾層、嚴重的肝功能或腎功能障礙、凝血功能障礙、活動性出血、惡性腫瘤、傳染病、既往感染史(<3個月)及其他炎癥性疾病或治療遵從性較差者。

        二、方法

        1.基本的臨床特征:研究對象的醫(yī)療記錄和冠脈造影數(shù)據(jù)資料完整而詳細。大多數(shù)數(shù)據(jù)來自病歷和導管室數(shù)據(jù)庫,包括人口學數(shù)據(jù)(如年齡和性別)、既往病史(如高血壓和糖尿?。?、家族史和個人史(如吸煙、飲酒)。體質量指數(shù)(body mass index,BMI)=體重/身高的平方(kg/m2)。

        2.生化指標:患者入院后次日上午行靜脈采血。北京友誼醫(yī)院臨床實驗室對所有受試者的血樣進行分析,包括總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油 (triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、白細胞計數(shù)、單核和淋巴細胞計數(shù)、高敏C反 應 蛋 白 (high-sensitivity C-reaction protein,hs-CRP)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、總膽紅素和間接膽紅素(據(jù)報道可以作為抗氧化因子參與炎癥反應過程[9-10])。

        3.淋巴細胞和單核細胞亞型的流式細胞學分析:以下抗人單克隆抗體(monoclonal antibody,MoAb)(購自美國加州圣地亞哥BioLegend公司)用于流式細胞學分析。PE抗人CD3抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)抗人CD4抗體、PerCP抗人CD8α抗體、PerCPCy55抗 人CD16抗體、抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)抗人CD19抗體和FITC抗人CD14抗體。冠脈造影后立即用肝素鈉抗凝血劑采集外周血,并在采集后1 h內(nèi)進行流式細胞分析:將100 μL的全血樣本與用上述抗體在室溫中染色30 min。加入2 mL 1×熒光激活細胞分選儀(fluorescence activated cell sorter,F(xiàn)ACS)溶解液(BD生物科學公司),將混合物輕輕旋轉,然后在黑暗中孵化10 min,使紅細胞溶解。將白細胞離心分離,并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌,然后懸浮在500 μL PBS中進行流式細胞術。用FACS Jazz細胞計對樣本進行分析(BD生物科學),使用FACS軟件(BD生物科學)操作。淋巴細胞和單核細胞亞群根據(jù)向前和側散射特性進行門控,使用FlowJo軟件(美國)對流式細胞術數(shù)據(jù)進行分析[7,11]。

        4.冠脈成像特征:通過穿刺橈動脈或者股動脈行冠脈造影,不使用腺苷或鈣通道阻滯劑。冠脈主要分為:左主干、左前降冠脈、左回旋支,右冠脈。冠脈血流情況[心肌梗死溶栓治療(thrombolysis in myocardial infarction,TIMI)幀數(shù)計數(shù)(TIMI frame count,TFC)][12],狹窄程度(Genisi評分確定)[13],以及擴張程度,由2位經(jīng)驗豐富的心臟專家閱片確定。

        三、統(tǒng)計學分析

        通過SPSS 25.0版進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)最初都通過科爾莫戈羅夫-斯米爾諾夫測試進行分析,以評估其正態(tài)性。連續(xù)數(shù)據(jù)顯示為正態(tài)分布時的x±s,以及非高斯分布時的中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)],通過單因素方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis法分析連續(xù)性數(shù)據(jù)。最小顯著性差異法或Nemenyi檢驗用于2組之間的多次比較。非參數(shù)數(shù)據(jù)按百分比(%)進行評估,并使用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗對各組進行比較。通過后退法對非經(jīng)典單核細胞進行多元線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        結 果

        一、患者一般情況

        3組研究對象在年齡、性別、高血壓發(fā)病率、血壓、血脂、肝功能、腎功能等基線數(shù)據(jù)方面差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。CAE組和CHD組患糖尿病的比例大于對照組(P<0.05),但3組之間糖化血紅蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

        表1 研究對象的基線特征[n(%)/±s/M(Q1,Q3)]

        表1 研究對象的基線特征[n(%)/±s/M(Q1,Q3)]

        CHD:冠心?。╟oronary heart disease);CAE:冠脈擴張(coronary artery ectasia);TC:總膽固醇(total cholesterol);TG:三酰甘油(triglycerides);HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol);LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol);ALT:谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase);AST:谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase)。

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        二、患者炎癥指標和冠脈造影特征

        3組患者白細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞淋巴細胞(neutrophil lymphocyte,NL)比值、ESR、hs-CRP、總膽紅素或直接總膽紅素等差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。CAE患者和CHD患者的冠脈狹窄范圍(冠脈各分支受累概率)和狹窄程度(Gensini積分)差異無統(tǒng)計學意義。CAE患者冠脈各分支的血流慢于CHD患者[LAD 39.50(33.00,48.25)比28.00(22.00,39.00),LCX 37.50(28.75,52.25)比25.00(19.00,37.00),RCA 30.00(24.00,44.00)比21.00(18.00,31.00)]。CAE患者中,右冠脈擴張受累的比例最高(76.5%);Markis分型Ⅰ型9例(26.5%)、Ⅱ型3例(8.8%)、Ⅲ型15例(44.1%)和Ⅳ型7例(20.6%)(見表2)。

        表2 3組患者炎癥指標和冠脈造影特征[n(%)/±s/M(Q1,Q3)]

        表2 3組患者炎癥指標和冠脈造影特征[n(%)/±s/M(Q1,Q3)]

        CHD:冠心?。╟oronary heart disease);CAE:冠脈擴張(coronary artery ectasia);NL比值:中性粒細胞/淋巴細胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio);hs-CRP:超敏C反應蛋白(high sensitivity C-reactive protein);ESR:紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate);TFC:心肌梗死溶栓治療冠脈血流幀數(shù)計數(shù)[thrombolysis in myocardial infarction(TIMI)frame count]。

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        三、淋巴細胞亞群和單核細胞亞群分析

        CAE組和CHD組之間的淋巴細胞亞型差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。然而,與CHD和對照組相比,CAE組的非經(jīng)典單核細胞比例顯著增加、經(jīng)典型單核細胞比例顯著下降(均P<0.05)(見表3、圖1)。

        圖1 外周血單核細胞亞群分析

        表3 淋巴細胞亞群和單核細胞亞群分析[M(Q1,Q3),%]

        四、多元線性回歸分析

        非經(jīng)典單核細胞的百分比值被設定為因變量,自變量包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙史、飲酒、BMI、hs-CRP、ESR、TC、TG、HDL-C、LDL-C、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)、NL比值、總膽紅素、直接膽紅素、ALT、AST、尿素氮、肌酐和Gensini評分。設定CAE、CHD和對照組分別為1、2和3,多元重線性回歸分析結果見表4:非經(jīng)典單核細胞的百分比值與組別和高血壓負相關,和炎癥指標(中性粒細胞、ESR)正相關。

        表4 以非經(jīng)典型單核細胞為因變量進行多重線性回歸

        討 論

        CAE是一種少見疾病,其病因尚不清楚。超過90%的CAE患者并發(fā)CHD,而其他患者則并發(fā)系統(tǒng)性血管炎(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和白塞病)、感染(如川崎病和肺炎衣原體感染)和遺傳性疾病[2,14-15]。目前認為大多數(shù)冠脈出現(xiàn)動脈粥樣硬化的CAE是一種炎癥性疾病,但是其典型的病理變化是冠脈中層的破壞甚至缺如,其表現(xiàn)類似于免疫異常參與血管炎的病理改變。因此,確定這些CAE患者是否合并免疫異常,對CAE的病因探討和治療有重要的臨床意義。本研究將CHD患者和冠脈相對正常的受試者作為對照,采集各組患者的新鮮外周血樣,提取其中的白細胞,然后用多種熒光抗體標記白細胞表面的抗原成分,通過流式細胞術探測熒光抗體的信號差異,從而間接分析外周血淋巴細胞和單核細胞的比例和亞型分布。

        本研究數(shù)據(jù)顯示,3組研究對象的基線數(shù)據(jù)具有可比性。CAE患者和CHD患者的冠脈狹窄范圍(冠脈各分支受累概率)和狹窄程度(Gensini積分)無明顯差異,提示在冠脈粥樣硬化病變程度上2組無明顯差異。關于炎癥指標,如白細胞計數(shù)、ESR、hs-CRP等,CAE和CHD組差異均無統(tǒng)計學意義,提示2組之間炎癥水平相當或因為樣本量的原因未能顯示出差異。關于淋巴細胞亞群的分布,CAE組與CHD組無明顯差異,提示CAE組可能并不涉及額外的免疫反應過程。關于單核細胞亞群,與CHD和對照組相比,CAE組的非經(jīng)典單核細胞水平顯著升高,經(jīng)典單核細胞水平顯著降低,隨后的多重線性回歸分析進一步證實了高非經(jīng)典型單核細胞比例與CAE相關,提示CAE患者處于一種炎癥狀態(tài)。

        非經(jīng)典單核細胞表達高水平的促炎因子,如腫瘤壞死因子和白介素1-β,具有促進炎癥反應作用。經(jīng)典型單核細胞修復組織和調節(jié)免疫功能,中間型單核細胞參與抗原的呈遞和血管生成。在炎癥條件下,經(jīng)典型單核細胞可發(fā)育為中間型和非經(jīng)典型單核細胞[7,11]。因此本研究中單核細胞表型的變化提示CAE存在炎癥反應狀態(tài)。以往研究提示CAE為一種炎癥性疾?。涸贑AE的冠脈血管壁中浸潤了大量炎癥細胞,包括中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞[16],同時CAE患者的外周血數(shù)種炎癥細胞因子增加等[17-19]。因此總體上,CAE是一種炎癥性疾病,與CHD相比,單核細胞可能更多地參與CAE的病理過程。

        CAE典型的病理學特征是嚴重的血管中層損傷,甚至完全沒有血管中層,蛋白酶降解可能在CAE患者細胞外基質的異常代謝過程中發(fā)揮重要作用[20-23]。炎癥、免疫紊亂、感染、遺傳變異或其他機制可能會影響血管中層的損傷。本研究表明,與CHD組比較,免疫系統(tǒng)紊亂可能并沒有參與CAE的病理過程,因為CAE患者的淋巴細胞亞型與CHD患者沒有顯著差異;同時其他研究也沒有發(fā)現(xiàn)CAE患者抗核抗體(antinuclear antibody,ANA)和抗中性粒細胞細胞質抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)(包括抗蛋白酶3ANCA和抗骨髓過氧化物酶ANCA)等與對照人群的差異[24]。因此,本研究推斷,CAE潛在發(fā)病機制更多的可能是炎癥過程,而不是免疫異常。未來需要更多研究來闡明CAE患者的炎癥狀態(tài)和病理變化的關系。

        總結本研究,大多數(shù)于冠脈造影中發(fā)現(xiàn)的伴隨CHD的CAE患者更可能是一種炎癥性疾病,而不是一種免疫性疾病。本研究存在一些不足和局限性,為單中心研究、樣本量有限、未提供參與者的后續(xù)隨訪數(shù)據(jù)。進一步的研究應包括更大的樣本量和詳細的隨訪,以獲得更多有用的臨床信息。

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