方莉萍 姜丹生 林樹梁 吳俊琪 王金華 浮苗

金華市中心醫(yī)院 浙江，金華 321000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種多因素的慢性疾病，主要病因是女性絕經(jīng)后卵巢功能低下，導致雌激素不足，骨量丟失過快、骨脆性明顯升高，其最嚴重的并發(fā)癥即骨質(zhì)疏松性骨折，是全球關(guān)注的一個健康問題[1]。臨床腎虛常見腎陰虛和腎陽虛，PMOP以腎陰虛證為主[2]。“證”是機體在各種致病因素影響下所發(fā)生的綜合表現(xiàn)，包括整體體質(zhì)反應特點及整體與外在環(huán)境之間、臟腑經(jīng)絡(luò)之間、細胞之間、細胞與體液之間的相互關(guān)系[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞之間的通訊是通過被膜包裹的小囊泡顆粒（稱為外泌體）介導的，它能夠與循環(huán)途徑中周圍細胞的細胞膜發(fā)生融合，釋放其所含的蛋白質(zhì)、DNA和RNA等，進而激活靶細胞內(nèi)的信號通路[5]。骨髓中的間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨再生的種子細胞，對維持正常骨代謝功能起到重要作用。BMSCs來源的外泌體在多種生理條件下更穩(wěn)定，無免疫原性，因此更適合于多種疾病的治療[6]。

BMSCs外泌體的特性使得它成為目前的研究熱點，但其在PMOP腎虛癥中的研究甚少。本研究在證候理論指導下，結(jié)合基于整體思維的系統(tǒng)生物學方法，探索PMOP腎陰虛證BMSCs外泌體差異基因表達變化，從分子水平尋找臨床防治PMOP腎陰虛證的關(guān)鍵基因及基因調(diào)控途徑，為PMOP腎陰虛證的機制研究提供新的見解。

1 材料和方法

1.1 研究對象 以金華市中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科2019年7月至2021年6月收治的股骨頭壞死或股骨頸骨折患者為對象。在人工股骨頭置換及全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)過程中，從股骨骨髓腔中抽取骨髓和血液，分離培養(yǎng)BMSCs。檢測肝腎功能、血尿常規(guī)、心電圖和B超等，以雙能X線骨密度儀檢測正位腰椎L1-4和左側(cè)股骨上端骨密度，聯(lián)合中醫(yī)辨證，共選擇40例患者，其中20例被診斷為PMOP腎陰虛證，20例為骨量正常對照組。納入標準：（1）骨質(zhì)疏松診斷參照世界衛(wèi)生組織PMOP的診斷標準[7]，中醫(yī)證候診斷標準參照文獻[8]；（2）無服用可能影響骨骼或鈣磷代謝的藥物史；（3）無影響骨代謝的全身性疾病；（4）無血液系統(tǒng)疾病及骨腫瘤等疾病；（5）所有參與研究的患者均知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：（1）不符合骨質(zhì)疏松癥診斷及中醫(yī)腎陰虛證辨證標準者；（2）因類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進等繼發(fā)骨質(zhì)疏松癥者；（3）合并心腦血管嚴重疾病，合并肝、腎功能檢查異常者；（4）最近1個月用過中藥治療骨質(zhì)疏松癥者，或近3個月內(nèi)行激素替代治療或使用降鈣素者，或近6個月內(nèi)有連續(xù)15 d以雙膦酸鹽等防治骨質(zhì)疏松癥者。本研究已獲得金華市中心醫(yī)院倫理委員會的倫理批準（2020-255-001）。

1.2 主要試劑和儀器 外泌體RNA分離試劑盒購于加拿大Norgen 有限公司（批號：25700）；TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green qPCR mix試劑盒均購于成都丹鳳科技有限公司（批號：K1622、K0521）。NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀為美國Thermo Scientific有限公司產(chǎn)品；Agilent Bioanalyzer 2100 生物分析儀購于美國Agilent Technologies有限公司。

1.3 BMSCs分離培養(yǎng)及其外泌體提取鑒定 采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)BMSCs，并鑒定其成脂和成骨分化能力，以流式細胞術(shù)檢測BMSCs細胞表型。取PMOP組及骨量正常對照組BMSCs第三代細胞培養(yǎng)上清液30 mL，以試劑盒提取外泌體。為了驗證外泌體提取的效果，通過免疫印跡法鑒定其標記蛋白CD9、CD63和CD81，并用透射電鏡分析外泌體的超微結(jié)構(gòu)，具體方法結(jié)果參考本課題組前期研究[9]。

1.4 外泌體RNA提取及基因芯片mRNA表達譜 隨機從兩組各取3例患者的BMSCs外泌體，分別命名為PMOP 1～3和C1～3，使用外泌體RNA分離試劑盒提取BMSCs外泌體總RNA，利用NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100生物分析儀檢測RNA完整性，送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進行高通量測序分析。

1.5 mRNA功能組分析 對標準化后的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析，利用P值和倍數(shù)變化值進行差異基因篩選，篩選標準為：P≤0.05，且上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥1.5。差異表達mRNA的聚類分析中選取P值最小的top 200繪制聚類圖。以log2（倍數(shù)變化值）為橫坐標，-log10（P值）為縱坐標，對差異表達分析中所有的基因繪制火山圖。通過基因本體分析（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，預測差異表達mRNA的生物學功能。

1.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)驗證分析 為驗證基因芯片結(jié)果的可靠性，提取20例PMOP腎陰虛證組和20例骨量正常對照組患者的BMSCs外泌體RNA，對部分差異表達的mRNA進行RT-qPCR驗證。按照說明書使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后采用SYBR green qPCR mix試劑盒進行RT-qPCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因。mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算，引物由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司設(shè)計，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 受試者一般資料分析 本研究共納入絕經(jīng)后女性40例，其中PMOP腎陰虛組20例，骨量正常對照組20例。見表2。隨機從兩組各取3例患者，分別命名為PMOP 1～3和C1～3，進行高通量測序分析。見表3。

表2 受試者一般資料比較Tab.2 Comparison of subjects' general data（）

表2 受試者一般資料比較Tab.2 Comparison of subjects' general data（）

注：BMI：體質(zhì)量指數(shù)；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。Note: BMI: body mass index;TC: total cholesterol;TG: triglyceride;HDL-C: high density lipoprotein cholesterol;LDL-C: low density lipoprotein cholesterol.

表3 測序組患者一般資料比較Tab.3 Comparison of general data in sequencing group

2.2 兩組患者BMSCs外泌體中mRNA的差異分析 比較兩組患者BMSCs外泌體中mRNA表達譜，將差異表達的標準化數(shù)據(jù)制作成熱圖。見圖1a。如果兩組中mRNA水平至少相差1.5倍，則認為其表達存在差異（P≤0.05）。兩組BMSCs外泌體鑒定出174個差異表達的mRNA，其中92個上調(diào)，82個下調(diào)。見圖1b?；蛐酒Y選的前10個顯著上調(diào)和前10個顯著下調(diào)的mRNA見表4。在mRNA失調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中，甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1）上調(diào)最多，log2（倍數(shù)變化值）為2.22，而γ-氨基丁酸受體相關(guān)蛋白1（γ-aminobutyric acid receptor associated protein like 1，GABARAPL1）的下調(diào)程度最大，log2（倍數(shù)變化值）為-2.18。

表4 基因芯片結(jié)果中上調(diào)和下調(diào)前10位mRNATab.4 Top 10 mRNA up-regulated and down-regulated in microarray results

圖1 兩組患者BMSCs外泌體中mRNA表達譜Fig.1 mRNA expression profiles in exosomes of BMSC in two groups

2.3 RT-qPCR驗證差異表達mRNA 為驗證基因芯片測序結(jié)果，選取10個mRNA（P≤0.05，倍數(shù)變化值≥2）進行RT-qPCR驗證。10個mRNA中4個上調(diào)（ATM、MAX、THBS3和WWTR1），6個下調(diào)（COL8A1、GABARAPL1、HLA-DQA1、HSPA1L、PPP2R2D和PTHLH）。為了確定這些mRNA在BMSCs外泌體中的表達水平，對20例PMOP腎陰虛證組和20例骨量正常對照組進行驗證。10個mRNA的表達譜與基因芯片檢測結(jié)果均一致。見圖2。兩組間ATM、COL8A1、GABARAPL1、HLA-DQA1、HSPA1L、MAX、PPP2R2D、PTHLH和WWTR1的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖2 兩組患者mRNA的RT-qPCR驗證Fig.2 RT-qPCR verification of mRNA in two groups

2.4 差異表達mRNA功能分析 對差異表達mRNA的進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能分析結(jié)果顯示，分子功能主要集中在DNA、RNA和蛋白質(zhì)的結(jié)合；生物功能主要集中在細胞和蛋白質(zhì)運輸、骨成熟參與、骨小梁形成、鈣離子結(jié)合方面；細胞功能主要集中在細胞核、細胞膜和線粒體中。見圖3a。KEGG富集結(jié)果顯示，差異mRNA在參與成骨分化的信號通路如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、自噬調(diào)節(jié)、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B，PI3K-AKT）、鈣離子信號通路、雌激素信號通路和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O（forkhead box transcription factor O，F(xiàn)oxO）亞族信號通路富集。見圖3b。

圖3 功能富集分析Fig.3 Functional enrichment analysis

3 討論

PMOP是一種多因素慢性疾病，隨著老年人口的增加，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢，PMOP成為了一個全球關(guān)注的健康問題[10]。由于缺乏有效的治療方法，探索PMOP的發(fā)病機制和尋找新的治療策略一直是PMOP研究的重要目標?！罢闩芍嗅t(yī)”骨傷學家肖魯偉發(fā)現(xiàn)中醫(yī)理論中的“髓”的概念與現(xiàn)代醫(yī)學的干細胞及其組織微環(huán)境在生物學上存在著高度相似性，將干細胞及其微環(huán)境功能紊亂引起骨與關(guān)節(jié)病損的骨傷疾病定義為“髓系骨病”，特別是對股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松癥、骨性關(guān)節(jié)炎，提出了髓系骨病的“腎虛髓萎”的病因病機學說[11]。本研究選擇了PMOP腎陰虛證組與骨量正常對照組的BMSCs，然后對其微環(huán)境外泌體內(nèi)的差異表達基因進行分析，通過基因芯片獲得了174個差異表達基因，其中92個上調(diào)，82個下調(diào)；RT-qPCR鑒定出的9個關(guān)鍵mRNA（ATM、COL8A1、GABARAPL1、HLA-DQA1、HSPA1L、MAX、PPP2R2D、PTHLH和WWTR1）與基因芯片數(shù)據(jù)一致，且在兩組間差異有統(tǒng)計學意義。

基于功能注釋分析，本研究發(fā)現(xiàn)MAPK和自噬調(diào)節(jié)是PMOP腎陰虛證組中差異表達基因顯著富集的通路。有研究報道，MAPK信號通路在調(diào)節(jié)成骨分化中起著至關(guān)重要的作用[12]。MAPK信號通路是缺氧觸發(fā)的核心調(diào)控通路，缺氧影響MSCs的細胞周期、增殖、凋亡、遷移和分化[13]。通過對HSPA1L進行調(diào)節(jié)，可保護MSCs免受凋亡衰老的影響[14]。最近研究表明，自噬與骨代謝疾病的發(fā)病機制具有相關(guān)性，包括骨硬化癥、Paget骨病和PMOP[15-17]。自噬可以抵抗衰老過程中的氧化應激反應，在PMOP 中起著重要作用[18]。GABARAPL1是一個與自噬相關(guān)的重要基因[19]，本研究提示其在PMOP腎陰虛證組下調(diào)最明顯。有研究證實，GABARAPL1存在于分泌型外泌體的外膜上，使用抗體封閉GABARAPL1 可導致外泌體的功能抑制，這使GABARAPL1可能成為疾病治療的一個新靶點[20]。因此，筆者推測GABARAPL可能成為PMOP腎陰虛證的一個非常有意義的治療靶點。

有學者利用藥理學方法來預測傳統(tǒng)中藥四物湯的活性化合物和潛在靶標，發(fā)現(xiàn)參與的信號通路有PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路和FoxO信號通路，四物湯可以通過干預與骨質(zhì)疏松癥發(fā)展有關(guān)的生物學過程和信號傳導通路起到治療骨質(zhì)疏松癥的效果[21]。PI3K-AKT信號通路可促進成骨細胞增殖、分化和成骨，從而抑制骨質(zhì)疏松癥[22]。本研究結(jié)果提示，PPP2R2D、THBS3和CDC37參與PI3K-AKT信號通路，這些基因可能與PMOP腎陰虛證發(fā)生相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，ATM基因參與FoxO信號通路，它是細胞氧化防御的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是一種參與DNA損傷反應的應激酶，是保持基因組完整性和干細胞更新所必需的，在調(diào)節(jié)成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子osterix的表達中起積極作用，正向調(diào)節(jié)成骨細胞分化和骨形成[23-24]。COL8A1是膠原蛋白，在骨質(zhì)流失和骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制中起著核心作用[25]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨內(nèi)骨化途徑中的關(guān)鍵基因PTHLH，與漢族女性PMOP有關(guān)[26]。

總之，本研究利用基因芯片篩選出PMOP腎陰虛證患者BMSCs外泌體相關(guān)的mRNA及其參與的信號通路，這些差異表達的mRNA是否可以成為PMOP腎陰虛證特異的mRNA，需要進一步驗證。本研究仍有不足之處，收集的病例均為股骨頭壞死或股骨頸骨折患者，可能造成選擇性偏倚，亟待在后期研究中改進。然而，本研究可能是較早應用高通量測序技術(shù)篩選PMOP腎陰虛證BMSCs外泌體相關(guān)mRNA的研究，篩選出的9個關(guān)鍵mRNA可能作為PMOP腎陰虛證患者的特異性診斷及預后靶點，為中醫(yī)“證”實質(zhì)的研究提供了新的突破口。