張 野，叢德毓，董 娜，施聰聰，趙家君，張紅石

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

失眠是比較常見的睡眠障礙，病程較緩且長，近半數(shù)可以持續(xù)十年以上[1]，同時普遍發(fā)病，嚴(yán)重影響人們身體健康，常常是心血管、腦血管以及內(nèi)分泌類疾病的誘導(dǎo)因素，給社會工作和家庭生活帶來不便和困擾。國際睡眠醫(yī)學(xué)指南對于失眠癥的診療論述雖然較全面，但是較少關(guān)注中醫(yī)物理療法的相關(guān)內(nèi)容，尤其目前關(guān)于推拿治療失眠癥的機制研究不足，難以作為證據(jù)支撐其有效性。而對于腦腸肽與失眠關(guān)系的研究，則有可能成為闡釋推拿治療失眠的發(fā)病機制突破點。

P物質(zhì)(substance p，SP)是激素肽家族的其中一種，是以激素的形式廣泛分布于消化系統(tǒng)中，并且以神經(jīng)遞質(zhì)的形式分布于中樞系統(tǒng)，類屬于腦腸肽。有研究表明在大鼠側(cè)腦室注射SP，可以增加睡眠時間，屬于中樞性促眠物質(zhì)[2]。在胃腸運動有明顯的促進(jìn)作用，有研究表明SP可引起胃腸道平滑肌收縮[3]，SP是一種參與腦腸互動系統(tǒng)的神經(jīng)肽。且在杏仁核、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)以及下丘腦等負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)情緒的腦區(qū)分布較豐富，同時在初級感覺神經(jīng)元的胞體及神經(jīng)纖維上有較高表達(dá)[4]。是一種存在于中樞性的促促進(jìn)睡眠的物質(zhì)，但必須通過睡眠中樞介導(dǎo)[5]。所以腹部推拿是可能通過促進(jìn)胃腸道活動，影響SP等物質(zhì)分泌，并改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)對睡眠的調(diào)控。

振腹環(huán)揉法是基于長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派的“通經(jīng)調(diào)臟”理論發(fā)展而來的一種推拿手法，以腹治腦，以腸調(diào)神為目的，通過對腹部的振動和環(huán)揉治療相關(guān)疾病[6]。振腹環(huán)揉法治療失眠具有豐富的臨床實踐，療效顯著。所以試通過分析振腹環(huán)揉法推拿對于PCPA失眠大鼠模型的不同取材和不同治療時間的SP含量差異，探討SP與振腹環(huán)揉法之間關(guān)系，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 取成年SD大鼠48只，雌雄各半，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司(生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)-2015-0005)，隨機分為4組，每組12只，空白組不造模不治療，模型組PCPA法造模后不干預(yù)；推拿組PCPA法造模通過振腹環(huán)揉推拿干預(yù)10 d，藥物組PCPA法造模后給予歸脾丸灌胃10 d。

1.2 主要儀器和試劑 D-4-綠本丙氨酸(麥克林CSA：7424-00-2)；戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；碳酸氫鈉(成都市科龍化工試劑廠)；阿拉伯樹膠粉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，津Q/HG NK 204-2000)大鼠SP酶聯(lián)免疫試劑盒(48T，血清、血漿，南京建成)；大鼠SP酶聯(lián)免疫試劑盒(96T，組織勻漿，南京建成)；組織勻漿器(塞維爾)；低溫高速離心機(Versati M22R)；酶標(biāo)儀(SYNERGY)。

1.2.1 模型建立 PCPA失眠大鼠模型建立：用碳酸氫鈉和純水配成5%弱堿性溶液，將碳酸氫鈉溶液滴入到0.9%氯化鈉溶液中，制備成弱堿性的生理鹽水(溫度10℃～40℃為宜)，調(diào)節(jié)pH為7～8之間備用，按400 mg/kg每只注射2 d的量稱取PCPA粉末，置于研缽中加入少許弱堿性生理鹽水研磨，并加10%阿拉伯膠繼續(xù)研磨，按1 mL/100 g在研磨好的PCPA中加入調(diào)節(jié)好PH值的溶液，定容而成 PCPA混濁液，用超聲機超聲15min。進(jìn)行大鼠腹腔注射，連續(xù)注射2 d。空白組腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.3 行為學(xué)觀察 失眠模型成功判定：為了觀察大鼠失眠程度，在首次注射后36 h，采用戊巴比妥鈉翻正實驗對PCPA失眠大鼠模型進(jìn)行評價，按50 mg/mL的比例將戊巴比妥鈉溶于生理鹽水中備用，給予每只大鼠劑量為35 mg/kg的戊巴比妥鈉，然后記錄大鼠翻正反射消失時間[7]，以及大鼠睡眠持續(xù)時間。將空白組與模型組進(jìn)行比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異則證明模型成功。

1.4 自發(fā)活動試驗 主要是根據(jù)大鼠舉爪行為活動程度觀察大鼠神經(jīng)興奮程度，在試驗前將大鼠分別在的各自鼠籠中適應(yīng)3 min，保持環(huán)境穩(wěn)定，然后開始記錄大鼠在2 min之內(nèi)的前肢舉爪離地次數(shù)作為活動指標(biāo)。分別在造模前、造模后、末次治療后1 h進(jìn)行測試。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 空白組 給予正常飲水和食物，腹腔注射等量生理鹽水，不予以任何干預(yù)治療，進(jìn)行實驗室檢測。

1.5.2 模型組 造模后，每天將實驗大鼠置于束縛鼠板仰臥位1次，不予振腹環(huán)揉法推拿，12 min后解開束縛，每天1次，連續(xù)操作10 d。

1.5.3 推拿組 采用“振腹法”和“環(huán)揉法”進(jìn)行腹部推拿。在腹部加以震動和環(huán)揉的兩個連續(xù)手法，采用振動頻率一致、重量統(tǒng)一的穴位震動按摩儀對大鼠進(jìn)行腹部推拿，穴位震動按摩儀頭端直立于大鼠腹部中脘穴周圍 2×2 cm部位操作，每次震動2 min，然后向下僅依靠按摩儀的重力順時針環(huán)揉 15 圈(2 min)，兩種方法交替操作3次，共12 min，每只大鼠每天干預(yù)1次，連續(xù)治療10 d。

1.5.4 藥物組 造模成功后按照人∶大鼠=1∶30的比例，將藥物劑量按照體重轉(zhuǎn)化為毫升數(shù)，灌服人參歸脾丸，由北京同仁堂股份有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號：國藥準(zhǔn)字Z11020104)，每日1次，連續(xù)灌胃10 d。

1.6 觀察指標(biāo) 觀察干預(yù)前后大鼠睡眠狀態(tài)，ELISA法檢測下丘腦、血清、小腸中SP的含量。干預(yù)5 d后上午10點對各組前6只大鼠取材，治療10 d后上午10點剩余大鼠取材。從大鼠腹主動脈取出血液樣本，用3000 rpm離心機離心15 min，取上清液分裝備用。取血后將下丘腦和小腸組織從大鼠體內(nèi)取出，迅速液氮冷凍，保存在-80℃冰箱中，用量按比1 g∶9 mL的比例，加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)使用勻漿機將標(biāo)本充分勻漿，以3000 rpm離心機離心15 min，取上清液備用。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 建模后結(jié)果 48只隨機分為空白對照組，模型組、推拿組、藥物組，每組12只，造模后模型組、推拿組、藥物組分別與空白組比較翻正反射消失時間，皆有所延長(P<0.01)；模型組、推拿組、藥物組3組造模后翻正反射消失時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后模型組、推拿組、藥物組分別與空白組比較翻正反射消失時間，皆有所縮短(P<0.01)；模型組、推拿組、藥物組3組造模后翻正反射消失時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示PCPA失眠大鼠模型造模成功，可以進(jìn)行實驗。見圖1。

圖1 各組大鼠造模前后翻正反射消失時間比較

2.2 干預(yù)后結(jié)果 造模后各組大鼠具有腹部糞便堆積現(xiàn)象，模型組出現(xiàn)斑禿現(xiàn)象。治療后推拿組與藥物組大鼠睡眠狀態(tài)均改善，睡眠時間延長廝斗現(xiàn)象減少，脫發(fā)程度明顯小于模型組，腹部推拿過程中大鼠會有較多大便排出。觀察自發(fā)舉爪次數(shù)結(jié)果顯示，模型組與空白組比較，明顯舉爪次數(shù)多，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，推拿組與模型組比較舉爪次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，藥物組與模型組比較舉爪次數(shù)也減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。通過ELISA實驗檢測治療5 d和治療10 d各組大鼠下丘腦、血清、小腸中SP濃度。下丘腦SP含量第5 d與第10 d比較模型組、推拿組、藥物組血清SP含量均升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療第10 d后，推拿組和藥物組與模型組比較，SP含量上升更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。大鼠血清SP含量第5 d與第10 d比較，模型組、推拿組、藥物組血清含量均顯著增高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，干預(yù)第10 d后，推拿組和藥物組與模型組比較，SP含量上升更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。PCPA失眠大鼠小腸SP含量第5 d和第10 d比較，模型組、推拿組、藥物組小腸SP含量增高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)第10 d后，推拿組SP含量上升更為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖2 大鼠自發(fā)舉爪次數(shù)

圖3 干預(yù)5 d和10 d大鼠下丘腦、血清、小腸中SP含量水平(n=6)

3 討論

失眠亦稱“不寐”，中醫(yī)學(xué)多分為心脾兩虛、肝郁化火、心腎不交、痰熱擾神、陰虛火旺等證型。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其發(fā)病機制的研究逐漸深入，很多關(guān)于失眠腦腸互動的研究被報道，而神經(jīng)肽類物質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn)為腦腸互動的機制增加了證據(jù)，例如食欲肽、膽囊收縮素、神經(jīng)肽S、神經(jīng)肽Y、β-內(nèi)啡肽、腦啡肽[8]、神經(jīng)肽Y[9]、血管活性肽[10]等，其中腦腸肽[11]被證明與失眠相關(guān)，這類物質(zhì)不僅存在和常產(chǎn)生于腦內(nèi)，在胃腸道也有大量存在，發(fā)揮調(diào)節(jié)腦腸互動作用，不僅能調(diào)節(jié)胃腸道消化吸收功能，也能調(diào)節(jié)睡眠，這與中醫(yī)學(xué)“胃不和則臥不安”的理論有相關(guān)之處，p物質(zhì)[6]亦為其中重要的一種。

《靈樞經(jīng)》記載“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其氣皆上于面而走空竅”，腹部分布有諸多經(jīng)脈，且腹下有諸多臟器，與全身機能密切相關(guān)，長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派經(jīng)過傳承實踐，據(jù)此提出“以腹治腦，以腸調(diào)神”的治療思想。振腹環(huán)揉法則是這一理論指導(dǎo)下的實踐應(yīng)用，治療失眠療效果明顯。在此臨床有效性研究基礎(chǔ)之上，腦-腸軸互動理論的研究為之提供了切實的理論依據(jù)，由于腦腸肽的發(fā)現(xiàn)，腦和胃腸的功能相關(guān)更加明確[12]。研究發(fā)現(xiàn)，多種腦腸多肽類物質(zhì)與其調(diào)控睡眠的功能密切相關(guān)，P物質(zhì)(substance p，SP)則是之一，SP是感覺神經(jīng)肽，在調(diào)控干細(xì)胞分化中扮演了重要角色，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)中都有分布[13]，能夠調(diào)節(jié)腦組織中多種物質(zhì)的表達(dá)水平，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過興奮下丘腦阜外測試前區(qū)神經(jīng)元促進(jìn)睡眠[14]，在胃腸系統(tǒng)中以激素的形式存在，主要起促進(jìn)胃腸運動的作用[15]。用組間t檢驗比較空白組大鼠5 d和10 d下丘腦、血清、小腸中SP含量，得出差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而比較模型組、推拿組、藥物組10 d后含量皆高于干預(yù)5 d后含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。用單因素方差分析比較大鼠血清、下丘腦、小腸10 d后SP含量，推拿組皆高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而藥物組雖都有所升高，但是升高程度相對推拿組略低。所以通過實驗說明振腹環(huán)揉法可以上調(diào)PCPA失眠大鼠血清、下丘腦、小腸中SP含量。此外通過行為學(xué)結(jié)果觀察，造模后各組大鼠具有腹部糞便堆積現(xiàn)象，模型組出現(xiàn)斑禿現(xiàn)象。在治療后推拿組與藥物組大鼠睡眠狀態(tài)均改善，睡眠時間延長廝斗現(xiàn)象減少，脫發(fā)程度明顯小于模型組，腹部推拿過程中大鼠會有較多大便排出。觀察自發(fā)舉爪次數(shù)結(jié)果顯示，模型組與空白組比較，明顯舉爪次數(shù)多(P<0.01)；推拿組與模型組比較舉爪次數(shù)明顯減少，(P<0.01)；藥物組與模型組比較舉爪次數(shù)也減少(P<0.05)。說明模型組比空白更易興奮，通過推拿治療后神經(jīng)興奮性明顯減輕，藥物組與模型組比較也有所減輕，從而證明振腹環(huán)揉法能夠改善大鼠失眠癥狀。

4 小結(jié)

本實驗通過對比5、10 d后各組大鼠下丘腦、血清、小腸中SP濃度，總結(jié)不同部位、不同治療時間的SP變化差異，結(jié)果顯示治療10 d后推拿組和藥物組對下丘腦、血清內(nèi)SP的影響皆較治療10 d后更顯著，推拿組和藥物組呈大致一樣趨勢。推拿和藥物組都能改善大鼠下丘腦、血清、小腸中SP濃度，而推拿組干預(yù)10 d后對小腸內(nèi)SP的影響要比藥物組更顯著。說明無論是腹部推拿或歸脾丸藥物治療，治療10 d的影響皆比治療5 d的影響更明顯，行為學(xué)結(jié)果表現(xiàn)與SP變化趨勢相對一致。總之振腹環(huán)揉法可以上調(diào)PCPA失眠大鼠血清、下丘腦、小腸中SP含量并且能夠改善大鼠失眠癥狀。然而本實驗收到樣本量和試驗條件的限制，仍需要設(shè)置更為精細(xì)的時間節(jié)點來觀察不同時段的SP含量變化，并且在未來實驗條件允許情況下或?qū)⒉捎胮cr或蛋白組學(xué)的檢測方法來明確闡釋和驗證這一試驗結(jié)果。