高留濤，李鵬濤，衡軍材，呂博博，王志丹，汪聰勇

（河南省鼎元種牛育種有限公司，鄭州 450046）

20世紀(jì)70年代以來，隨著胚胎移植技術(shù)水平的不斷提高，胚胎移植已成為奶牛生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的輔助生殖手段。胚胎移植是實現(xiàn)高遺傳水平個體快速擴繁的重要手段，可以充分發(fā)揮公母畜的遺傳優(yōu)勢，對于牧場的牛群品種改良或擴繁優(yōu)質(zhì)基因具有重大意義。通過胚胎移植，可以快速培育優(yōu)秀的種公、母牛。而胚胎移植后妊娠成功率的提高受多種因素的影響，如收集胚胎時的溫濕度、胚胎質(zhì)量、受體牛發(fā)情周期、子宮疾病、胎次和胚胎類型等[1,2]。利用荷斯坦牛冷凍胚胎進行胚胎移植開展種公牛培育是目前國內(nèi)種公牛培育的重要途徑，可以有效降低種牛培育成本，避免疫病等風(fēng)險。近年來，開展胚胎移植效果的研究內(nèi)容很多，本文主要研究了受體牛發(fā)情類型、受體牛利用次數(shù)、黃體類型、不同操作人員和受體牛月齡等方面對胚胎移植后受孕率的影響，以期為優(yōu)化胚胎移植技術(shù)、提高荷斯坦牛冷凍胚胎移植成功率提供技術(shù)理論及實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本試驗中的數(shù)據(jù)來源于河南省某育種公司于2021年1-3月份在山東某奶牛養(yǎng)殖場進行冷凍胚胎移植研究的資料，共收集了931條胚胎移植數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)主要包括受體牛只發(fā)情類型、受體牛只利用次數(shù)、移植時間、黃體位置、黃體類型及孕檢情況等。

1.2 胚胎及受體牛

胚胎來源于美國進口頂級胚胎。受體牛來源于山東某奶牛養(yǎng)殖場，為24月齡以下的青年荷斯坦牛，健康無疾病且發(fā)育正常。

1.3 胚胎移植過程

1.3.1 移植時間

在受體母牛發(fā)情后（發(fā)情當(dāng)天為第0天）第7天（6～8d）用非手術(shù)法進行胚胎移植。

1.3.2 胚胎解凍

用水浴解凍方法對冷凍胚胎進行解凍。從液氮罐中取出裝有胚胎的0.25mL塑料細管，在空氣中停留3～5s，然后放入30℃的水杯中，40s后取出，用紙巾擦干。

1.3.3 胚胎移植過程

采用非手術(shù)法進行胚胎移植：①對照供體牛采胚記錄表和合格受體牛的發(fā)情記錄，合理搭配受體和胚胎；受體牛在發(fā)情后6～8d之間均可進行胚胎移植。②受體牛實行1～2尾椎間硬外膜麻醉，擦拭外陰部。③解凍胚胎，用乙二醇為冷凍劑生產(chǎn)的胚胎可直接進行解凍移植，不需要重新裝管。④細管裝入移植槍內(nèi)。⑤把裝有細管的移植槍套上硬外套，用塑料環(huán)卡緊，再套上軟外套。⑥將胚胎移植到受體牛有黃體一側(cè)子宮角上1/3～1/2處。⑦做好受體牛移植記錄。

1.3.4 妊娠診斷

用直腸檢查法進行妊娠診斷。在胚胎移植后60d用直腸觸摸的方法對移植受體牛進行檢查，判斷是否妊娠。

1.4 統(tǒng)計分析

使用Excel對數(shù)據(jù)進行整理，各處理組的受孕率差異采用卡方檢驗進行分析，當(dāng)期望計數(shù)＜5時，采用費希爾精確檢驗。P＜0.05時表示差異顯著，0.05＜P＜0.1時表示有差異趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)情類型對于冷凍胚胎移植受孕率的影響

由表1可知，自然發(fā)情和同期發(fā)情奶牛的移植受孕率差異不顯著（P＞0.05）。

表1 發(fā)情類型對受孕率的影響

2.2 受體牛只利用次數(shù)對于冷凍胚胎移植受孕率的影響

由表2可知，移植次數(shù)對受胎率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 移植次數(shù)對受胎率的影響

2.3 操作人員對于冷凍胚胎移植受孕率的影響

由表3可知，人員C的胚胎移植受孕率顯著低于人員A和B（P＜0.05），而人員D的移植受孕率與其他各組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 移植人員對受胎率的影響

2.4 黃體類型對于冷凍胚胎移植受孕率的影響

由表4可知，1級黃體的移植受孕率要顯著高于3級黃體和4級黃體（P＜0.05），2級黃體的移植受孕率與其他各組差異不顯著（P＞0.05）。二級黃體受孕率有小于一級黃體受孕率的趨勢（0.05＜P＜0.1），但也有大于三級黃體受孕率的趨勢（0.05＜P＜0.1）。

表4 黃體類型對受胎率的影響

2.5 受體牛月齡對于冷凍胚胎移植受孕率的影響

由表5可知，20～21月齡牛的移植受孕率顯著大于16～17月齡（P＜0.05）。18～19月齡牛胚胎移植受孕率與其他兩組無顯著差異（P＞0.05），但20～21月齡受孕率有大于18～19月齡受孕率的趨勢（0.05＜P＜0.1）。

表5 受體牛月齡對受孕率的影響

3 討論

3.1 受體牛發(fā)情類型及利用次數(shù)對于胚胎移植受胎率的影響

在本研究中，受體母牛發(fā)情類型對于胚胎移植后受胎率沒有顯著影響，使用的同期藥物在引發(fā)母牛情期開始上與自然發(fā)情效果一致。Sugiura等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛排卵前60～12h，誘導(dǎo)發(fā)情奶牛的子宮內(nèi)膜厚度要顯著大于自然發(fā)情奶牛。而哺乳動物的子宮內(nèi)膜對妊娠的形成和維持至關(guān)重要，子宮內(nèi)膜過薄或過厚均與動物的生育能力相關(guān)[4,5]。這也可能是同期藥物處理的奶牛胚胎移植受胎率略高于自然發(fā)情奶牛的原因。但在總體受孕率上，同期發(fā)情較自然發(fā)情在使用效果上差異不明顯，因此在實際生產(chǎn)中可以加以推廣使用驗證。雖然受體母牛利用一次和兩次的受胎率無顯著差異，但是利用一次的受體牛受胎率要高于利用兩次的受體牛。Irikura等[6]研究發(fā)現(xiàn)，隨著人工輸精次數(shù)的增加，日本黑牛從第一次輸精受孕率51.4%降低到第四次及以上輸精受胎率29.6%。而侯藎褒等[7]同樣發(fā)現(xiàn)，二次配種受孕率較一次配種受孕率減低6個百分點，與本試驗研究所得結(jié)果一致。

3.2 操作人員對于胚胎移植受胎率的影響

在本研究中，不同移植操作人員的胚胎移植受孕率有所不同，人員A和B的移植受孕率顯著高于人員C。鄒阿玲等[8]統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，不同操作人員的胚胎移植受胎率最高可達67.1%，最低為37.5%，差異極顯著，這與張震等[9]的研究相一致。不同操作人員的手法、操作細膩程度對受體母牛的損傷及造成的應(yīng)激不同，專業(yè)操作能力強的技術(shù)人員能夠?qū)κ荏w母牛子宮環(huán)境做出準(zhǔn)確判斷，降低移植過程中受體牛的應(yīng)激程度，因此整體胚胎移植受胎率較高。相反，初學(xué)者對于胚胎移植位置把握不準(zhǔn)確，操作手法粗放，牛只應(yīng)激強烈，都會導(dǎo)致受胎率降低。胚胎移植工作大面積推廣，需要有專業(yè)人員的指導(dǎo)，技術(shù)操作人員應(yīng)善于總結(jié)，才能培養(yǎng)出優(yōu)秀的胚胎移植技術(shù)操作人員。

3.3 黃體類型對于胚胎移植受胎率的影響

胚胎移植的成功不僅與高質(zhì)量胚胎和良好的子宮環(huán)境相關(guān)，還與受體母牛黃體形態(tài)及大小相關(guān)。黃體大小及形態(tài)對胚胎移植受胎率的研究較多，據(jù)桑潤滋[10]報道，受體牛黃體直徑越大，移植受胎率越高，這和協(xié)超等[11]的研究結(jié)果一致，但王建國[12]的研究發(fā)現(xiàn)黃體直徑大小與胚胎移植受胎率無顯著影響。本試驗根據(jù)受檢時黃體大小及形態(tài)特征對黃體進行分類，發(fā)現(xiàn)各種類型的黃體受孕結(jié)果不同。其中，黃體組織大小對胚胎移植受胎率無明顯影響，這與Thomson等[13]的研究結(jié)果一致。而黃體形態(tài)對于移植受胎率產(chǎn)生顯著影響，形態(tài)呈圓錐狀、頂端發(fā)育明顯的黃體較呈蘑菇狀、頂端平整的黃體受孕率更高。

3.4 受體母牛月齡對于胚胎移植受胎率的影響

動物年齡對其繁殖性能有著至關(guān)重要的影響。從本研究結(jié)果來看，在一定時間段內(nèi)，隨著胚胎移植受體母牛月齡的增長，胚胎移植受胎率相應(yīng)在提高。研究發(fā)現(xiàn)2～6周歲受體牛的受孕率高于2周歲以內(nèi)的青年受體牛[14]和7歲以上的受體牛[15]。同樣地，陳江凌發(fā)現(xiàn)，13～18月齡的受體牛胚胎移植后流產(chǎn)率明顯高于19～23月齡[16]。由此可見，隨著受體母牛月齡的增長，其生殖系統(tǒng)發(fā)育成熟，機體內(nèi)環(huán)境逐漸穩(wěn)定，有利于胚胎的著床受孕。而年齡過大的受體母牛因其繁殖力降低，子宮疾病易發(fā)等原因可能造成胚胎移植后受孕率降低。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在荷斯坦牛冷凍胚胎移植過程中，受體母牛的發(fā)情類型和移植次數(shù)未對移植后受孕率產(chǎn)生顯著影響；操作能力強的技術(shù)人員能夠提高胚胎移植母牛的受孕率；一級黃體的移植受孕率顯著高于其他類型的黃體；胚胎移植受體母牛的受孕率隨母牛年齡的增長而提高。