王重一 鄧洋洋 高巳東 林浩楠

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是一種以骨密度降低、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的全身代謝性骨骼疾病[1]。

鹿茸，血肉有情之品，具有溫腎壯陽，補(bǔ)益精血等功效[2]，其主要成分甾體類化合物[3]與鹿茸多糖[4]具有治療骨質(zhì)疏松癥的功效。Hippo信號(hào)通路作為近些年研究熱點(diǎn)，已證實(shí)其與骨質(zhì)疏松癥之間存在多元關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，成骨細(xì)胞數(shù)量減少或轉(zhuǎn)化能力降低等生物學(xué)行為與OP的發(fā)生密切相關(guān)。本研究以Hippo信號(hào)通路為切入點(diǎn)，試探究鹿茸提取液誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，為臨床防治OP以及骨代謝失常引起的其他慢性疾病提供有效的中醫(yī)藥治療方案，并為其作用機(jī)制提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

SD大鼠BMSCs(凍存代次P2)購自賽業(yè)(蘇州)。

1.2 試劑與藥品

試劑：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基和茜素紅均購自賽業(yè)(蘇州)；PBS、DMSO以及多聚甲醛固定液均選自Hyclone；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR? Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)，ROX plus均購買于Takara公司；MST1、YAP、RUNX2和β-actin一抗均購買于Cell Signaling。

藥品：鹿茸提取液。將鹿茸凍干粉過篩(80目篩)，將過篩后的粉末放入DMEM中, 制成濃度為0.78 mg/mL的鹿茸提取液，再經(jīng)過計(jì)算與配制，最終配制成1 μg/mL的低濃度鹿茸提取液。鹿茸提取液為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國 Thermo公司)；IX71 型倒置相差顯微鏡(Olympus, 日本)；Labofuge 400R 型臺(tái)式離心機(jī)(Heraeus，德國)；InfiniteM200型多功能酶標(biāo)儀(奧地利TECAN)；Stratagene Mx3000p 熒光定量PCR儀(Agilent Technologies 美國)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，中國)；大鼠ALP ELISA試劑盒(AMEKO，中國)。

1.4 方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1BMSCs的分組與培養(yǎng)：將細(xì)胞分為3組，正常組(大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青霉素鏈霉素)，誘導(dǎo)組(大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青霉素鏈霉素、谷氨酰胺+20 μL地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)，鹿茸組(鹿茸提取液濃度為1 μg/mL)。

1.4.2ALP活性測(cè)定：采用ELISA法，分別檢測(cè)成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第 6、12天以及18天的ALP水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及樣品測(cè)定方法按照說明說操作。在490 nm的波長處檢測(cè)OD值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔的濃度。

1.4.3茜素紅染色：將BMSCs放入12孔板，每組2個(gè)孔，培養(yǎng)18 d后觀察其生長分布后，將各孔的培養(yǎng)基吸出，滴入茜素紅染液后將12孔板放進(jìn)CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜待30 min。隨后取出用PBS浸泡清洗，待表面無殘留水液后，鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的形態(tài)及密度變化。

1.4.4qRT-PCR法檢測(cè)MST1，YAP以及RUNX2 mRNA表達(dá)水平測(cè)定：提取細(xì)胞RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MST1，YAP以及RUNX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.4.5Westernblot法檢測(cè)檢測(cè)MST1，YAP以及RUNX2的蛋白表達(dá)：首先將冷凍后的血清標(biāo)本解凍，再使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)樣本蛋白定量，然后用30 μg蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，而后繼續(xù)使用封閉液進(jìn)行封閉處理。以上步驟完成后加入各一抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)4 ℃過夜孵育，加入二抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)室溫下孵育1 h后，TBST漂洗膜3次后在膜上滴上發(fā)光液，在凝膠成像儀上顯示條帶，使用Image J軟件分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組BMSCs ALP活性比較

與正常組相比，6、12和18 d誘導(dǎo)組的ALP活性和水平均顯著上調(diào)(P<0.01)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間增加，細(xì)胞裂解液中ALP水平逐漸上升，第18天達(dá)到最高值。相應(yīng)的鹿茸組，6和12 d的鹿茸組ALP活性和水平變化不明顯(P>0.05)，而第18天鹿茸組的ALP活性和水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與誘導(dǎo)組相比，6、12和18 d鹿茸組的BMSCs ALP活性和水平顯著降低(P<0.01)，詳見表2。

表2 各組6、12 d以及18 d的BMSCs ALP活性比較(μg/L,

2.2 各組鈣結(jié)節(jié)情況

由圖可見，BMSCs誘導(dǎo)18 d后，與正常組(A)相比，誘導(dǎo)組(B)和鹿茸組(C)的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目多且密集，而誘導(dǎo)組(B)與鹿茸組(C)相比，鹿茸組(C)的鈣結(jié)節(jié)最多且密集成片，由此證明鹿茸提取液對(duì)于促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)的形成效果更加明顯。詳見圖1。

注：A：正常組；B：誘導(dǎo)組；C：鹿茸組。

2.3 qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果。

與正常組相比，誘導(dǎo)組和鹿茸組YAP和RUNX2 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，MST1 mRNA的表達(dá)均顯著下降(P<0.01)；與誘導(dǎo)組相比，鹿茸組MST1 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，而YAP和RUNX2 mRNA的表達(dá)顯著下降(P<0.01)，但其活性較強(qiáng)。詳見表3。

表3 各組細(xì)胞MST1、YAP和RUNX2 mRNA表達(dá)的比較

2.4 Western blot法檢測(cè)結(jié)果

與正常組相比，誘導(dǎo)組的YAP和RUNX2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，而MST1蛋白表達(dá)水平則呈現(xiàn)顯著下降(P<0.01)，相應(yīng)的鹿茸組YAP蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，RUNX2蛋白表達(dá)水平同樣上調(diào)(P<0.05)，而MST1蛋白表達(dá)水平則呈現(xiàn)下降(P<0.05)；與誘導(dǎo)組相比，鹿茸組MST1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，而YAP和RUNX2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)。詳見圖2、圖3、表4。

表4 各組細(xì)胞MST1、YAP和RUNX2蛋白表達(dá)水平的比較

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與誘導(dǎo)組相比，##P<0.01。A：正常組；B：誘導(dǎo)組；C：鹿茸組。

圖3 MST1、YAP和RUNX2的蛋白表達(dá)水平柱狀圖Fig.3 Protein expression histogram of MST1, YAP and RUNX2

3 討論

3.1 “腎-精-髓-骨”與OP

有關(guān)于“腎-精-髓-骨”的理論最早出現(xiàn)在《黃帝內(nèi)經(jīng)》的諸多篇幅中，從中醫(yī)上表述腎主骨的概念已傳承千載，其內(nèi)涵為腎精滋養(yǎng)且如潤骨骼。而骨骼作為其“靶器官”與腎中之精存在密切聯(lián)系，維系腎與骨之間的物質(zhì)是骨髓，而骨髓由腎精所化生，骨骼的強(qiáng)健與否和腎中精氣盛衰密切相關(guān)，因此眾多實(shí)驗(yàn)與臨床治療多從“腎”與“骨”之間的關(guān)系入手。而由于年老體衰或婦女絕經(jīng)等原因，腎虛所致精不足，精虧累及髓的化生不足，髓不養(yǎng)骨導(dǎo)致骨骼脆弱，正如《靈樞·本神》所記載：“精傷則骨酸痿厥”。由此可見，腎精滋養(yǎng)是人體的骨骼正常發(fā)育生長基本前提，也是維持骨骼強(qiáng)健的本元。當(dāng)腎藏精功能失常，精不足則髓不化，導(dǎo)致骨失所養(yǎng)，會(huì)形成多種骨代謝疾病。

3.2 “BMSCs”與OP

近些年BMSCs作為研究的熱點(diǎn)，其在防治OP方面功不可沒。BMSCs主要存在于人體骨髓中，是一種多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可經(jīng)誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，類似中醫(yī)學(xué)中的“精”和“髓”。BMSCs具有增殖和多向分化能力，在本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，BMSCs經(jīng)鹿茸提取液誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞并迅速大量增殖，證明BMSCs其分化為成骨細(xì)胞對(duì)促進(jìn)骨形成有著重要的作用，其在防治OP或促進(jìn)器官發(fā)育等生理功能方面占據(jù)重要的地位。

3.3 Hippo信號(hào)通路與“BMSCs”

成骨細(xì)胞的分化對(duì)于骨穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的，只有當(dāng)骨形成和骨吸收維持在平衡狀態(tài)的情況下才能保證骨穩(wěn)態(tài)，當(dāng)骨吸收大于骨形成時(shí)，骨穩(wěn)態(tài)被打破，會(huì)誘發(fā)骨代謝疾病，所以維持骨穩(wěn)態(tài)是保證骨重塑的關(guān)鍵。對(duì)于OP的治療，應(yīng)當(dāng)是促進(jìn)BMSCs的成骨分化為主，本研究中，qRT-PCR與Western biot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在與正常組對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組的YAP和RUNX2 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，也有研究[5]證明，Hippo信號(hào)通路可以促進(jìn)對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化增殖，在Hippo-YAP信號(hào)通路中，下游關(guān)鍵效應(yīng)因子YAP活性的強(qiáng)弱會(huì)影響到BMSCs的增殖與分化。在敲除掉YAP后，BMSCs成骨分化受到限制[6]，表明下游關(guān)鍵效應(yīng)因子YAP對(duì)于BMSCs的增殖分化起到至關(guān)重要的作用。

3.4 補(bǔ)腎填精中藥與“BMSCs”成骨分化

作為補(bǔ)腎填精中藥的代表之一鹿茸，其在治療OP備受專家和學(xué)者的青睞，唐中堯等[7]通過數(shù)據(jù)檢索，發(fā)現(xiàn)在臨床上治療OP的常用中藥中，鹿茸的出現(xiàn)頻率為48.4 %。鹿茸中含有蛋白多肽、多糖等多種成分，而鹿茸多肽的比重更多，其成分占據(jù)一半以上[8]。鹿茸多肽由賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸等組成[9]，具有廣泛的藥理作用，在防治PMOP方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究[10]證明，鹿茸多肽可明顯提高去卵巢大鼠骨組織中成骨細(xì)胞標(biāo)志RUNX2水平，并上調(diào)其基因表達(dá)，提高骨組織中RUNX2的蛋白表達(dá)，與其對(duì)照組相比，顯著提高了去卵巢大鼠的骨密度。而在本研究中，通過鹿茸提取液誘導(dǎo)后，BMSCs 的ALP水平及活性均有所提升，而ALP則是成骨細(xì)胞的一種早期特征性生物標(biāo)志物[11]，且第18天鹿茸組的ALP活性和水平顯著上調(diào)，ALP可進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化，茜素紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹿茸組鈣結(jié)節(jié)最多且密集成片，由此證明鹿茸提取液對(duì)于促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)的形成效果更加明顯。在qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，鹿茸組的MST1、YAP和RUNX2的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平同樣表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，這也佐證了鹿茸在促進(jìn)BMSCs的成骨分化和防治OP方面發(fā)揮了積極地作用，同時(shí)鹿茸在促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分轉(zhuǎn)化以防治骨質(zhì)疏松癥的同時(shí)還具有安全且不良反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)。

綜上，圍繞中醫(yī)“腎主骨”及其相關(guān)的理論知識(shí)，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)研究前沿，通過補(bǔ)腎填精中藥鹿茸促進(jìn)BMSCs的增殖分化為成骨細(xì)胞防治OP具有良好研究的前景，深入探索相關(guān)機(jī)制可為Hippo信號(hào)通路的臨床研究提供新的研究方向，為骨質(zhì)疏松癥的研究帶來潛在治療靶點(diǎn)，為臨床技術(shù)的推廣帶來新思路。