鄧滿香 陳鷺玲 何劍全

廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院，福建 廈門 361000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞骨脆性增加的全身性疾病[1-2]。骨微結(jié)構(gòu)主要受到骨代謝的影響，可參與骨重建，具有維持骨結(jié)構(gòu)及功能完整性的作用[3]。OP患者存在骨微結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為成骨細(xì)胞分化及聚集降低、骨小梁分布降低、骨脆性增加、提高骨折發(fā)生風(fēng)險。骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BAP)是由成骨細(xì)胞分化而成，可增加羥磷灰石沉積，抑制骨鹽形成，是反映成骨細(xì)胞活性及骨形成的敏感指標(biāo)[4]。氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)是存在于血液循環(huán)中和慢性腎病及心腦血管疾病關(guān)系密切的指標(biāo)。以往文獻(xiàn)[5]證實，糖尿病腎病患者血清中TMAO表達(dá)升高并隨著疾病加重而升高，但與OP疾病水平暫無研究。核因子Kappa B (nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種具有生物調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生物活性及免疫應(yīng)答等，在OP時表達(dá)升高可促進(jìn)骨炎癥反應(yīng)[6]。活化T細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子c1 (nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATcl)是重要轉(zhuǎn)錄因子，在破骨細(xì)胞中可結(jié)合上游信號通路提高破骨細(xì)胞活性及提高骨基質(zhì)的降解作用[7]。

雞冠花(Celosia cristata L)為莧科草本植物，其性溫、無毒，藥理作用具有收澀、止血、止帶扽功效。近些年，國內(nèi)外大量學(xué)者對雞冠花的有效成分進(jìn)行分析，其黃酮類活性物質(zhì)更為豐富，具有抗衰老、抗腫瘤、提高免疫能力及抗骨質(zhì)疏松等作用[8]。本文通過建立老年OP大鼠，觀察雞冠花黃酮提取物對骨微結(jié)構(gòu)、骨特異性磷酸酶及TMAO-NF-κB/NFATc1水平的影響，為OP臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗大鼠

50只SPF級SD雄性大鼠，16周齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，平均體重300～350 g，許可證號：SCXK(粵)2020—0028，在常溫下濕度為55%下分籠喂養(yǎng)，5只1籠。所有涉及動物的操作嚴(yán)格遵循實驗動物倫理要求。模擬黑白交替無菌飲食2周及按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進(jìn)行實驗。

1.2 主要材料與方法

4 %多聚甲醛(Sigma-Aldrich Inc，USA)；0.9 %生理鹽水(中國大冢制藥有限公司)；兔抗TMAO；NF-κB, NFATc 1抗體(Cell Singal Technology，美國)；GAPDH抗體(Proteintech，美國)；伊紅-蘇木精染色液(杭州華東醫(yī)藥有限公司)；自動生化分析儀(Au5400 Beckman Coulter Inc., Massachusetts CA, USA)；普通顯微鏡(Olympus, Japan)；蛋白電泳儀(北京六一儀器)。

1.3 雞冠花黃酮提取物制備

我院微生物與免疫學(xué)教研室于2020年10月中下旬采收普通雞冠花的花序；除去種子和莖梗，烘干后粉碎備用。乙醚回流抽提7 h，脫脂后的樣品再用95 %乙醇于65 ℃水浴上提取6 h，蒸發(fā)干燥得粉劑，溶解后再過濾除菌。

1.4 分組、OP模型制備及干預(yù)方法

將大鼠隨機(jī)分為Sham組、模型組、干預(yù)組及藥物對照組，術(shù)前禁食12 h、禁水6 h，1 %戊巴比妥鈉麻醉，用量4 mg/kg，四肢刺激無反應(yīng)，麻醉成功。于兩側(cè)肋下剃毛，消毒后，在肋下2 cm脊柱旁1.5 cm作縱向開口，腹腔內(nèi)找到菜花樣卵巢組織結(jié)扎并切除，無活動出血后將周圍組織塞入腹腔并縫合皮膚，Sham組保留卵巢切除周圍脂肪組織，依次縫合切口，加壓包扎，術(shù)后常規(guī)皮下注射青霉素1萬U/d，連用3 d，預(yù)防感染。采集陰道分泌物進(jìn)行涂片檢查，鏡檢脫落細(xì)胞密集者為去勢成功。去勢成功且血鈣和雙側(cè)脛骨骨密度明顯低于Sham組，為老年骨質(zhì)疏松模型制備成功。剔除死亡大鼠6只。Sham組、模型組、干預(yù)組及藥物對照組分別為13只、模型組9只、干預(yù)組11只、藥物對照組11只。干預(yù)組采用雞冠花黃酮提取物100 mg/(kg.d)灌胃，藥物對照組采用0.3 g/kg的鈣爾奇碳酸鈣D3片，其余大鼠均灌胃等體積0.9 %的生理鹽水，每日灌胃1次，連續(xù)干預(yù)16周。

1.5 血清Ca、P、ALP及BAP水平

收集大鼠尾部靜脈血2 mL，加入無抗凝劑的試管中，離心分離沉淀的血清以4 000 r/min 10 min，檢測上清液中鈣(Ca)、磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)及骨特異性堿性磷酸酶(BAP)水平。

1.6 micro CT測量股骨骨微結(jié)構(gòu)及骨密度

干預(yù)后，麻醉處死大鼠，分離雙側(cè)股骨組織，采用手術(shù)刀剃凈股骨大分布組織，將左側(cè)股骨放入浸泡于10 %福爾馬林固定，用于骨微結(jié)構(gòu)micro CT分析，分組股骨組織骨密度(BMD)利用該系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析并經(jīng)自動統(tǒng)計給出結(jié)果。

1.7 HE染色檢測組織病理形態(tài)

組織浸入10 %的甲醛溶液，固定過夜，自來水沖洗，浸泡于14 %的EDTA溶液中脫鈣，逐級脫水經(jīng)石蠟包埋后4 μm切片后備用。各組股骨組織切片放入37 ℃復(fù)溫15 min，二甲苯脫蠟后按照100 %-95 %-85 %及75 %乙醇-100 %蒸餾水進(jìn)行逐級水化，蘇木精染色10 min，鹽酸(1%)處理，伊紅復(fù)染，梯度乙醇脫水，封片后觀察組織形態(tài)。

1.8 免疫組化檢測TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)

股骨組織剪切成小塊，脫水、包埋后，采用甲醛固定，水化后，37.5 ℃靜置后0.5 h后，加入1 % 的EDTA液，山羊血清封閉。加入TMAO抗體(1∶500)、NF-κB(1∶700)及NFATc1(1∶1000)抗體，加入二抗0.5 h后，復(fù)染，封片。以淡黃色至棕褐色，為陽性，隨機(jī)選取每一張免疫組化切片的5個視野，并用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.9 免疫印跡檢測TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白表達(dá)

股骨組織加入胰蛋白裂解液，離心后采取上清液加入樣孔。進(jìn)行電泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，5 min/次，分別加入TMAO抗體(1∶1 000)、NF-κB(1∶800)及NFATc1(1∶1 500)抗體、過加入抗兔IgG二抗(1∶2 000)，雜交5 min采用PBS沖洗3次，后放入ECL工作液中，隨后進(jìn)行檢測，獲取圖象。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平比較

與Sham組相比，模型組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平均降低(P<0.05)，與模型組相比，干預(yù)組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平升高(P<0.05)；干預(yù)組與藥物對照組上述指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平比較Table 1 Comparison of serum Ca, P, ALP and BAP levels in each

2.2 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)及骨密度比較

Sham組股骨組織中骨小梁多呈現(xiàn)板狀，致密均勻。模型組大鼠股骨組織骨小梁稀疏，與模型組大鼠股骨組織相比，干預(yù)組及藥物對照組大鼠股骨組織骨小梁數(shù)量、骨小梁連接密度均提高，見圖1。Sham組、模型組、干預(yù)組及藥物對照組的骨密度BMD分為(58.05±6.11)mg/cm3、(47.50±4.53)mg/cm3、(55.17±5.14)mg/cm3及(54.96±5.40)mg/cm3，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.983，P<0.001)，與Sham組比較，模型組BMD降低(P<0.05)，與模型組相比，干預(yù)組BMD升高(P<0.05)，干預(yù)組和藥物對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)比較Fig.1 Comparison of bone microstructure in each group

注：與Sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.3 HE染色觀察各組大鼠股骨組織病理形態(tài)

Sham組大鼠股骨形態(tài)飽滿，排列整齊無斷層，骨小梁形態(tài)連續(xù)，未見空洞。模型組骨小梁組織變細(xì)，骨小梁出現(xiàn)斷裂及不連續(xù)，骨基質(zhì)紊亂分布，骨密質(zhì)間斷裂及較多空洞形成。干預(yù)組及藥物對照組骨小梁組織逐漸改變，排列緊致，骨基質(zhì)紊亂改善空洞減少。見圖3。

圖3 各組大鼠股骨組織形態(tài)比較(50×)Fig.3 Comparison of the morphology of femur in each group (50×)

2.4 免疫組化檢測各組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)

與Sham組相比，模型組大鼠股骨組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)較高(P<0.05)，與模型組相比，干預(yù)組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)組和藥物對照組上述指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖4。

圖4 各組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)Fig.4 Positive expression of TMAO, NF-κB and NFATc1 in each group

表2 各組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)

2.5 免疫印跡檢測各組大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平

與Sham組相比，模型組大鼠股骨組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)較高(P<0.05)，與模型組相比，干預(yù)組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)組和藥物對照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平

3 討論

鈣和磷都是人體必需元素，99 %的鈣均是以羥基磷灰石結(jié)晶形式儲存在骨組織中，1 %的鈣主要分布在體液及軟組織中，可參與凝血及肌肉收縮等作用。80 %磷以磷酸鈣的形式儲存在骨組織中，磷可輔助鈣共同調(diào)控機(jī)體生理功能[9-10]。ALP主要表達(dá)在骨鈣化區(qū)域，聯(lián)合水解酶作用磷酸酯釋放鈣以沉淀方式附著于膠原骨架上，有利于成骨。BAP是由肝臟及成骨細(xì)胞合成，在成骨過程中可水解成磷酸脂，其表達(dá)升高有利于骨形成[11]。本文研究表示，干預(yù)組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平均高于模型組，說明雞冠花黃酮提取物可通過增加OP骨代謝指標(biāo)而改善骨質(zhì)疏松。相關(guān)研究[12]證實，植物雌激素可有效抑制絕經(jīng)后骨量丟失，黃酮類物質(zhì)已經(jīng)被證實增加骨質(zhì)量而增加骨形成。雞冠花黃酮是從雞冠花中提取的有效活性成分，對OP中血鈣及血麟具有調(diào)節(jié)作用，可通過減少骨鈣修飾而改善OP。Cho等[13]研究表示，雞冠花生物學(xué)功能廣泛，可增加骨密度而減少鈣流失的同時，通過體外成骨細(xì)胞實驗，發(fā)現(xiàn)雞冠花黃酮提取物可通過增加成骨細(xì)胞活性而增加礦化能力。因此本文推測雞冠花黃酮提取物可能是通過增加成骨細(xì)胞活性，提高骨質(zhì)量而增加BAP表達(dá)。

圖5 各組大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平Fig.5 Protein levels of TMAO, NF-κB and NFATc1 in each group

本文采用Micro CT對各組大鼠股骨組織骨小梁進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重建，可對骨小梁厚度、間距及體積進(jìn)行分析，可通過獲得骨參數(shù)可預(yù)測骨強(qiáng)度。BMD表示骨密度，是骨骼強(qiáng)度的重要指標(biāo)。謝菲爾德大學(xué)學(xué)生健康中心認(rèn)為BMD水平降低是導(dǎo)致OP疾病發(fā)生的主要原因，也是合并骨折發(fā)生的危險因素[14]。國際學(xué)者研究表明，在OP大鼠中采用雙能X線骨密度檢測儀器能夠通過評估BMD含量而反映OP改善程度[15]。黃酮類化合物及衍生物對可被用來抗骨質(zhì)疏松，雞冠花黃酮提取物抗OP主要機(jī)制在于可增加成骨細(xì)胞活性，提高骨密度增加骨形成量，還可通過減少破骨細(xì)胞募集而改善骨吸收，還可通過加快骨膠原合成及基質(zhì)礦化而發(fā)揮抗OP作用。李萬里等[16]研究表示，在成骨細(xì)胞體外實驗中采用雞冠花黃酮提取物培養(yǎng)后，IGF-1表達(dá)升高說明雞冠花黃酮提取物可增加成骨細(xì)胞活性而增加骨小梁厚度發(fā)揮預(yù)防OP的作用。

本文研究表示，干預(yù)組大鼠股骨組織中TMAO、NF-κB、NFATc1表達(dá)均低于模型組，說明雞冠花黃酮提取物可抑制TMAO、NF-κB、NFATc1水平抑制老年OP。TMAO屬于一類促炎性反應(yīng)因子，在糖尿病及腎臟疾病中TMAO升高可增加氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。慢性腎臟疾病可導(dǎo)致人體礦物質(zhì)及骨狀態(tài)發(fā)展改變，可增加患者OP發(fā)生及骨折發(fā)生風(fēng)險，TMAO升高可加重糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展而加快OP形成，因此抑制其表達(dá)可一定程度上發(fā)揮骨保護(hù)作用。OP發(fā)生時氧化應(yīng)激持續(xù)激活可增加NF-κB表達(dá)，可與 TNF-α 受體(TNFR) 結(jié)合后增加骨基質(zhì)細(xì)胞分泌因子κB 受體活化因子受體配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL) 及巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖、分化，抑制其凋亡，增強(qiáng)其骨吸收能力[18]。NFATcl是破骨細(xì)胞形成及分化過程中必不可少的調(diào)節(jié)因子，當(dāng)其被敲除后采用RANKL刺激后破骨細(xì)胞無法分化，說明NFATcl對于破骨細(xì)胞形成及功能發(fā)揮中具有重要作用[19]。黃酮類提取物可對NF-κB及其受體RANKL發(fā)揮抑制作用，例如補(bǔ)骨脂異黃酮可通過抑制NF-κB激活而減少破骨細(xì)胞分化而增加成骨細(xì)胞活性而減少骨量丟失，對OP發(fā)揮改善作用。雞冠花還有豐富的黃酮類化合物，可發(fā)揮抗炎癥、抗氧化應(yīng)激及抗OP作用。李萬里等[20]研究表示，雞冠花黃酮提取物對氟中毒骨代謝異常大鼠可通過改善骨代謝紊亂，降低炎癥反應(yīng)而提高骨密度，促進(jìn)骨形成。本文推測雞冠花黃酮提取物可通過發(fā)揮強(qiáng)大抗炎癥作用而抑制NF-κB及其受體RANKL表達(dá)，降低破骨細(xì)胞活性而預(yù)防OP發(fā)生發(fā)展。

本文研究存在一定不足，未建立不同濃度的雞冠花黃酮提取物組別，時間及經(jīng)費受限，可能影響實驗結(jié)果。今后加強(qiáng)與其他單位聯(lián)合增加實驗方法和實驗結(jié)果，為老年OP治療提供實驗依據(jù)。綜上所述，老年骨質(zhì)疏松大鼠采用雞冠花黃酮提取物干預(yù)后可顯著改善骨微結(jié)構(gòu)，提高骨特異性磷酸酶活性增加骨密度，機(jī)制可能與抑制TMAO、NF-κB、NFATc1表達(dá)相關(guān)。