劉昕 李圓圓 劉紅 李艷 潘靜華 王少君 趙宏艷

中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心 北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室，北京 100700

破骨細胞是骨骼系統(tǒng)疾病、骨代謝疾病等研究的常用細胞。破骨細胞的培養(yǎng)方法有多種，其中采用小鼠單核巨噬細胞RAW264.7誘導破骨細胞的方法，因操作簡單，誘導形成的破骨細胞數(shù)目多、均一性好、雜質少，且具有良好的骨吸收能力被廣泛應用。課題組在文獻研究[1-5]及實驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用小鼠單核巨噬細胞RAW264.7誘導分化的破骨細胞表面可見大量未分化細胞，這影響了破骨細胞形態(tài)的觀察及功能的檢測。通過對文獻的分析及課題組的前期實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基可能影響小鼠單核巨噬細胞RAW264.7誘導分化破骨細胞的過程?；诖?，本研究擬探討了培養(yǎng)基對小鼠單核巨噬細胞RAW264.7誘導生成破骨細胞的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)；核因子κ B受體活化因子配體(RANKL，美國R&D公司，貨號462-TEC，批號CWA2520083 )；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(美國SIGMA公司，貨號387A-1KT，批號SLBZ5562)；高糖DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司，貨號C11885500BT，批號8121231)；α-MEM培養(yǎng)基(國家實驗細胞資源共享服務平臺，貨號202000001，批號20200102)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司，貨號D2660-100 mL，批號RNBK1994)；牛骨片(美國IDS公司，貨號DT-1BON1000-96，批號J44137)；SYBR Fast qPCR Mix(日本Takara公司，貨號RR430A，批號AJF2238A)；PrimeScript RT Master Mix(日本Takara公司，貨號RR036A，批號AJ90850A)。

1.2 方法

1.2.1文獻檢索和篩選要求：檢索中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫、Pub Med數(shù)據(jù)庫，檢索年限為2011年12月至2021年12月。以“RAW264.7”、“破骨細胞”、“RANKL”為中文檢索詞，以“RAW264.7”、 “Osteoclast”、“RANKL”為英文檢索詞，使用布爾邏輯“AND”進行檢索，分析小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞向破骨細胞分化的常用培養(yǎng)基。

文獻的納入標準：①納入對照研究，不限制分組方法；②小鼠單核巨噬細胞RAW264.7使用RANKL誘導的破骨細胞模型。文獻的排除標準：①腺病毒感染、轉染后的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7；②共培養(yǎng)實驗；③重復發(fā)表的文獻只保留一篇；④數(shù)據(jù)報告不完整；⑤相同培養(yǎng)基文獻數(shù)量少于10篇；⑥會議論文。

通過檢索共獲得704篇文獻，排除348篇文獻，最終納入356篇文獻，其中英文153篇，中文203篇。文獻檢索流程見圖1。其中使用DMEM培養(yǎng)基的文獻為225篇；采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、24 h貼壁后改用α-MEM培養(yǎng)基誘導分化的文獻為45篇；采用α-MEM培養(yǎng)基的文獻為86篇。

圖1 文獻檢索流程圖Fig.1 The flow chart of literature search

1.2.2細胞培養(yǎng)方法及分組：小鼠單核巨噬細胞RAW264.7用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基或含10 %胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞狀態(tài)良好后，按上述文獻檢索的結果將本實驗分為3組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導分化組(DMEM組)、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h貼壁后改用α-MEM培養(yǎng)基誘導分化組(DMEM/α-MEM組)、α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導分化組(α-MEM組)。將細胞分別以2×103個/孔接種于96孔板、6×104個/孔接種于6孔板，24 h貼壁后更換為相應的含50 ng/mL RANKL的分化培養(yǎng)基，隔天換液一次。

1.2.3破骨細胞形態(tài)觀察及計數(shù)方法[6]：TRAP是破骨細胞的特異性標志酶，按上述方法培養(yǎng)至第5 d，采用TRAP染色方法鑒定破骨細胞。TRAP染色陽性且細胞核大于3個以上者認定為破骨細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察破骨細胞的形態(tài)并計數(shù)。

1.2.4破骨細胞功能的檢測方法[7]：按上述方法以2×103個/孔接種于提前放置無菌骨片的96孔板中，24 h后更換為50 ng/mL RANKL的分化培養(yǎng)基，隔天換液。培養(yǎng)11 d后取出骨片在0.25 mol/L氫氧化銨中超聲清洗5 min，去除骨片表面的細胞，然后用1 %甲苯胺藍染色10 min，用蒸餾水沖洗3次。在顯微鏡下觀察骨陷窩形態(tài)并拍照，使用Image pro plus軟件對骨吸收面積進行分析。

1.2.5破骨細胞分化相關轉錄調控因子(NFATc-1、c-Fos、TRAF-6)的表達：按上述方法以6×104個/孔密度接種于6孔板中，按上述方法培養(yǎng)5 d后收集各組細胞。加入Trizol裂解液提取各組RNA，反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量 PCR 方法檢測NFATc-1、c-Fos、TRAF-6 mRNA的表達。以 GAPDH為內參基因，根據(jù)2-△△CT值相對定量樣本中目的基因表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司設計，目的基因引物序列具體見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Target gene primer sequences

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同培養(yǎng)基對破骨細胞分化的影響

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7為貼壁細胞，形態(tài)較小，增殖快。經(jīng)RANKL刺激后，細胞逐漸聚集成團，第3 d開始各不同培養(yǎng)基組均可見少量較小的多核細胞，第5 d均可見大小不等的多核細胞，形態(tài)不規(guī)則，有的呈煎蛋形、有的呈圓形等，且在多核細胞表面均可見不同程度未分化細胞，見圖2。

注：紅色箭頭標記的為破骨細胞。

2.2 不同培養(yǎng)基對破骨細胞分化的影響

培養(yǎng)第5 d后，各組均可以觀察到典型的TRAP+破骨細胞。DMEM組TRAP+破骨細胞大小不均一，有細胞脫落的痕跡。此外，在破骨細胞表面有大量成團塊狀的染色呈黑紫色的未分化細胞。DMEM/α-MEM組和α-MEM組TRAP+破骨細胞分布較均勻，未見有細胞脫落的痕跡，且未分化細胞較少(圖3A)。與DMEM組相比，DMEM/α-MEM組、α-MEM組TRAP+破骨細胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)，DMEM/α-MEM與α-MEM組之間差異無統(tǒng)計學意義(圖3B)。

注：與DMEM組比較，**P<0.01。

2.3 不同培養(yǎng)基對破骨細胞骨吸收功能的影響

骨陷窩可以反映破骨細胞的骨吸收功能。培養(yǎng)11 d后各組均可以觀察到明顯的骨吸收陷窩，但骨吸收陷窩形態(tài)略有不同。DMEM組骨陷窩邊界不清晰，形態(tài)多為圓形、橢圓形，陷窩染色淡呈紫色，陷窩大小不一，有的可見較大的單個骨吸收陷窩。DMEM/α-MEM組骨陷窩邊界清楚，呈小圓形，陷窩染色深呈深紫色，單個骨陷窩面積小，零散分布。α-MEM組骨陷窩邊界清楚，呈小圓形、卵圓形，陷窩染色深呈藍紫色，單個骨陷窩面積不大，多個陷窩聚焦成堆(圖4A)。與DMEM組和DMEM/α-MEM組相比，α-MEM組骨陷窩面積明顯增加(P<0.01)(圖4B)。

注：A ：紅色箭頭標記的為骨吸收陷窩；B：與DMEM組比較，**P<0.01；與DMEM/α-MEM組比較，##P<0.01。

2.4 不同培養(yǎng)基對破骨細胞分化因子的影響

不同培養(yǎng)基組均可以檢測到破骨細胞分化相關轉錄調控因子NFATc-1、c-Fos、TRAF-6 mRNA的表達。與DMEM組相比，α-MEM組NFATc-1、c-Fos和TRAF-6 mRNA表達顯著增加(P<0.01，P<0.05)；DMEM/α-MEM組與DMEM組相比，NFATc-1 mRNA表達顯著增加(P<0.01)，c-Fos和TRAF-6 mRNA表達有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。α-MEM組與DMEM/α-MEM組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖5)。

3 討論

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7誘導分化為破骨細胞受多種因素的影響[8-10]，如傳代次數(shù)、接種濃度、RANKL 濃度、誘導時間、培養(yǎng)基等。在諸多影響因素中，培養(yǎng)基是最容易被忽視的一個環(huán)節(jié)。通過文獻研究我們發(fā)現(xiàn)，使用最多的是高糖DMEM培養(yǎng)基、其次是α-MEM培養(yǎng)基，還有的文獻采用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、24 h貼壁后改用α-MEM培養(yǎng)基分化。通過本研究，我們證實在RANKL 存在的條件下，以上3種培養(yǎng)基均可誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7分化成破骨細胞，但破骨細胞形態(tài)、破骨細胞分化因子的表達水平及破骨細胞骨吸收功能不盡相同。與高糖DMEM培養(yǎng)基相比，α-MEM分化培養(yǎng)基中成熟的破骨細胞數(shù)量及破骨細胞分化相關因子明顯的表達增加、破骨細胞骨吸收功能也明顯增強。這與曾汝君等[11]研究結果一致，但是研究中具有典型的破骨細胞形態(tài)的細胞減少，且沒有做破骨細胞骨吸收功能的檢測。形態(tài)差異的原因可能與細胞傳代次數(shù)、接種濃度等因素有關。

通過文獻研究我們發(fā)現(xiàn)，小鼠單核巨噬細胞RAW264.7誘導分化破骨細胞使用最多的是高糖DMEM培養(yǎng)基，這可能與美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)推薦高糖DMEM培養(yǎng)基為該細胞培養(yǎng)基有關。許丹等[12]研究也表明用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞RAW264.7時，會出現(xiàn)細胞貼壁不牢的現(xiàn)象；且與低糖型 DMEM 相比，用高糖DMEM 培養(yǎng)的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 傳代后貼壁更快，細胞生長速度更快。所以較多研究采用高糖 DMEM 培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞RAW264.7。但也有文獻采用α-MEM培養(yǎng)基，這可能與培養(yǎng)目的有關。當小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 用于誘導破骨細胞實驗時，α-MEM培養(yǎng)基比高糖DMEM培養(yǎng)基更適合。高糖DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為25 mmol/L)與α-MEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.6 mmol/L)在成份上最主要的差別是葡萄糖濃度的不同。Karner 等[13]研究表明，當葡萄糖濃度為5 mmol/L時，破骨細胞生成效果最佳，而高濃度的葡萄糖，雖然可以最大程度地刺激了細胞增殖，但其破骨細胞生成效果較低。

本研究也發(fā)現(xiàn)采用高糖DMEM培養(yǎng)基不僅抑制了破骨細胞的分化，還導致小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 過快的增殖，這些增殖的細胞粘附于破骨細胞表面，從而影響了破骨細胞的分化及功能。DMEM/α-MEM組雖然破骨細胞形態(tài)與未分化細胞數(shù)量介于DMEM與α-MEM組之間，但是骨吸收功能明顯弱于α-MEM組，可能是培養(yǎng)基的突然更換，雖然對破骨細胞形態(tài)影響不明顯，但分化因子的表達及骨吸收功能仍未達到α-MEM組水平。本研究結果表明，在采用小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 誘導分化破骨細胞的研究中，α-MEM比高糖DMEM更適合做為破骨細胞的分化培養(yǎng)基。