郭勝男 戚曉楠 姚嘯生 任路* 陳文娜*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(primary osteoporosis，POP)是一種常見的骨科疾病，其特征表現(xiàn)為慢性的骨密度下降，骨微結(jié)構(gòu)退化及低創(chuàng)傷性骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。中醫(yī)將其歸屬于“骨痿”、“骨枯”等范疇。利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (ultra performance liquid chchromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法研究中醫(yī)“證候”的代謝物差異，為建立基于證型的客觀標(biāo)準(zhǔn)和物質(zhì)量化指標(biāo)提供了客觀依據(jù)。本研究旨在通過家系隊(duì)列，開展POP中腎陽虛證型的代謝組學(xué)研究，為中醫(yī)藏象學(xué)說在臨床辨證論治相關(guān)疾病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料

于2019年5月1日至2021年7月31日期間，在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科門診和病房收集符合腎陽虛P(yáng)OP的患者，建立家系隊(duì)列。要求同時(shí)滿足POP且為腎陽虛的患者作為先證人，通過先證人聯(lián)系其一級家屬(父母、子女、同胞)，如其一級家屬也同時(shí)患有POP且為腎陽虛，其所在家族可納入家系隊(duì)列。共收集到20例腎陽虛P(yáng)OP患者作為疾病組(DO組)；先證人配偶所在家系中排除POP或腎陽虛證的健康者12例作為對照組(CN組)，其資料情況見表1。

1.2 病例診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：滿足其中任何一項(xiàng)均可診斷。①中軸骨或非優(yōu)勢側(cè)橈骨遠(yuǎn)端1/3骨密度的T值≤-2.5；②-2.5

1.2.2中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)符合以下3項(xiàng)方可確診。①依據(jù)國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》的證候分型標(biāo)準(zhǔn)確診為腎陽虛證；②依據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定自測表——陽虛質(zhì)》量表評分測定，轉(zhuǎn)化分?jǐn)?shù)>30分可確診；③由3名副高級職稱以上中醫(yī)醫(yī)師獨(dú)立辨證，至少需兩名醫(yī)生診斷“腎陽虛證”可確診。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合入選先證家系；②符合POP西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；③證候?yàn)槟I陽虛證者；④臨床病史及檢驗(yàn)資料相對完整者；⑤受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①可能影響體內(nèi)骨代謝的相關(guān)疾病，如惡性腫瘤、內(nèi)分泌疾病等；②當(dāng)前或過去存在血液、腎臟、肝臟、精神或神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；③長期服用影響骨代謝的藥物(如糖皮質(zhì)激素)者。

1.5 倫理審批

本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意實(shí)施[編號為2019064FS(KT)-040-02]。

1.6 UPLC-MS/MS采集條件

UPLC-MS/MS采集檢驗(yàn)系統(tǒng)包括超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜。T3液相使用沃特世ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(1.8 μm，1 mm×100 mm)。流動相的柱溫設(shè)置為40 ℃，使用0.4 mL/min流速運(yùn)行，A相為超純水，B相為乙腈，各含0.1 %甲酸。Amide液相使用沃特世ACQUITY UPLC?BEH Amide色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)。A相為含甲酸銨(20 mmol/L)和氨(0.4 %)超純水，B相為純乙腈，運(yùn)行流速、柱溫與T3液相相同。質(zhì)譜采集時(shí)電噴霧離子源溫度設(shè)為500 ℃，質(zhì)譜電壓正極為5 500 V，負(fù)級為4 500 V。離子源氣體1流速設(shè)為55 Psi，氣體2流速設(shè)為60 Psi，氣簾氣設(shè)為25 Psi，并設(shè)高參數(shù)的碰撞誘導(dǎo)電離。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 代謝組學(xué)的質(zhì)控分析

質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，質(zhì)控樣本總粒子流曲線相互重疊性高，見圖1。結(jié)果表明各峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，說明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中儀器偏差引起的變異較小，反映本研究使用的儀器穩(wěn)定性較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性較好。

圖1 質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測總粒子流重疊圖Fig.1 Figure of quality control sample mass spectrometry detection

分組主成分分析結(jié)果顯示DO組和CN組之間代謝物有分離趨勢，見圖2和圖3。而偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)模型得分圖(圖4)顯示，DO組和CN組發(fā)生了明顯的分離。其中模型置換測試參數(shù)R2X (cum) = 0.392，R2Y (cum) = 0.989，Q2(cum) =0.711，提示該模型是有效的。

圖2 分組主成分分析圖Fig.2 Map of principal component analysis

圖3 分組主成分分析三維圖Fig.3 Three-dimensional map of principal component analysis

圖4 偏最小二乘判別分析圖Fig.4 Map of PLS-DA score S-plot

2.2 差異代謝物的篩選

利用PLS-DA和其正交信號的結(jié)果初步篩選出差異代謝物，VIP值≥1的代謝物以紅色圓點(diǎn)表示，<1的代謝物以綠色圓點(diǎn)表示，見圖5。進(jìn)一步以VIP>1，P<0.05，F(xiàn)C≥1.2或≤0.65為條件，共篩選出157個(gè)差異性代謝物。

圖5 正交偏最小二乘判別分析圖Fig.5 Map of OPLS

對篩選的差異代謝物原始相對含量采用標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過R軟件繪制熱圖，結(jié)果見圖6。腎陽虛P(yáng)OP患者血清γ-氨基丁酸、犬尿酸、尿黑酸、L-異亮氨酸、黃嘌呤、鳥苷、腺苷、十二烷二酸、肉堿 C18∶3等93個(gè)代謝物上調(diào)，谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、肌氨酸、苯乙酰甘氨酸、3-羥基馬尿酸、苯乙酰甘氨酸等64個(gè)代謝物下調(diào)。

2.3 KEGG通路富集分析

分析發(fā)現(xiàn)腎陽虛P(yáng)OP患者血清差異代謝物主要參與色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、磷脂酶D信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等信號通路，結(jié)果見圖7。

圖7 腎陽虛P(yáng)OP的差異代謝物KEGG富集圖Fig.7 KEGG enrichment map of different metabolites in Yan deficiency syndrome of primary osteoporosis

3 討論

本研究采用家系隊(duì)列的研究方法，先建立腎陽虛家系隊(duì)列，再進(jìn)行病例納入，以此造成了兩組間性別和年齡的分布差異。與CN組比較，DO組中女性數(shù)量占比較多，年齡增高，該特征與臨床腎陽虛P(yáng)OP患者以老年女性居多的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相一致[1]。

腎主骨生髓，與骨骼的生長發(fā)育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，POP存在氨基酸和脂質(zhì)方面的代謝變化[2-3]。Zhao等[4]發(fā)現(xiàn)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型中氨基酸和核苷酸代謝下調(diào)，而脂質(zhì)代謝上調(diào)。本研究經(jīng)UPLC-MS/MS法篩選出157個(gè)血清差異代謝物，氨基酸、有機(jī)酸、甘油磷脂和核苷酸及其代謝產(chǎn)物是其主要差異代謝物種類。

3.1 氨基酸及其代謝產(chǎn)物

POP存在一定程度的氨基酸代謝紊亂。精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸均能促進(jìn)胰島素分泌，增強(qiáng)胰島素樣生長因子-1的作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[5-6]；脯氨酸、苯丙氨酸可抑制破骨細(xì)胞生成，減少POP中的骨吸收[7]。谷氨酸可通過與破骨細(xì)胞表達(dá)的谷氨酸受體結(jié)合促進(jìn)骨吸收，谷氨酰胺升高則與低骨礦物質(zhì)密度呈正相關(guān)[8-9]。尿黑酸中黑色素過量沉積可引起關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)和退行性病變，出現(xiàn)廣泛的椎間盤層狀鈣化和POP[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DO組，谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和天冬氨酸水平降低，尿黑酸、γ-氨基丁酸增多。

纈氨酸可增強(qiáng)腸道對鈣的吸收，提高機(jī)體血清鈣水平。纈氨酸代謝紊亂在POP的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶缺陷可能為POP的潛在因素[9]。雖然亮氨酸與纈氨酸的吸收速度類似，但You等[9]認(rèn)為POP患者不存在亮氨酸的異常代謝情況，這與本研究的結(jié)果不一致。

現(xiàn)有研究[11]認(rèn)為，腎陽虛與神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)聯(lián)系密切。腎陽虛患者常表現(xiàn)為四肢不溫、言語無力、易疲勞、夜尿頻多，性欲減退，面色發(fā)白，脈沉遲無力，這與交感神經(jīng)功能不足的臨床表現(xiàn)相似。丙氨酸還可轉(zhuǎn)化生成苯乙酰甘氨酸，與腎上腺素受體結(jié)合興奮交感神經(jīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，DO組中苯乙酰甘氨酸水平降低，與張愛華[13]研究結(jié)果一致。以上結(jié)果顯示，腎陽虛可能與苯乙酰甘氨酸下調(diào)以及腎上腺素受體結(jié)合能力降低有關(guān)，此觀點(diǎn)有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

肌氨酸在骨骼肌的能量代謝中發(fā)揮重要作用。犬尿喹啉酸又稱犬尿酸，其在脂肪組織中具有提高機(jī)體能量利用、刺激脂肪代謝和產(chǎn)熱的功能。在本研究中，DO組內(nèi)血清肌氨酸含量減少，犬尿酸含量增多，提示腎陽虛P(yáng)OP患者骨骼肌供能可能相對不足，這與齊敏瑞等[14]的研究結(jié)果相一致。肌氨酸和犬尿酸還可以影響神經(jīng)系統(tǒng)。肌氨酸紊亂與精神疾病的發(fā)生有關(guān)，而腦內(nèi)犬尿酸累積會擾亂睡眠，引起意識紊亂[15-16]。同時(shí)，谷氨酸和天冬氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性氨基酸，而γ-氨基丁酸是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。在本研究中涉及能量代謝和影響神經(jīng)系統(tǒng)的這些差異代謝物可能對解釋腎陽虛的本質(zhì)有一定意義。

3.2 脂質(zhì)及其代謝產(chǎn)物

POP的發(fā)生發(fā)展與脂質(zhì)代謝失調(diào)密切相關(guān)[9,17-19]。尹恒等[3]發(fā)現(xiàn)小鼠股骨骨質(zhì)疏松的發(fā)生與脂質(zhì)變化相關(guān)，表現(xiàn)為脂肪?；?、甘油脂、甾醇、一些甘油磷脂和神經(jīng)酰胺增加，另一部分甘油磷酸膽堿和鞘脂類則呈下降趨勢。脂質(zhì)增加可激活核轉(zhuǎn)錄因子(過氧化物酶體增殖物激活受體γ)，抑制成骨細(xì)胞分化[20-22]。POP小鼠血漿溶血磷脂酰膽堿和ROS顯著上調(diào)，氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致骨質(zhì)丟失和骨脆性增強(qiáng)[23-24]。絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松小鼠鞘磷脂明顯減少，鞘糖脂和神經(jīng)酰胺增加，表明鞘脂代謝失調(diào)與骨代謝異常密切相關(guān)[25]。此外，維生素D3及其產(chǎn)物和甾醇酯類似物增加可促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致POP[26]。在本研究中，腎陽虛P(yáng)OP患者血清游離脂肪酸包括十二烷二酸、肉堿 C18∶3等增多，其具體機(jī)制不清。

3.3 核苷酸及其代謝產(chǎn)物

在核苷酸物質(zhì)中，黃嘌呤和次黃嘌呤是嘌呤核苷酸的代謝過程中的中間產(chǎn)物，尿苷和胞苷則存在于嘧啶代謝途徑中。本研究中，腎陽虛P(yáng)OP患者血漿黃嘌呤含量顯著上升，提示組織中上游次黃嘌呤堆積，DNA合成速度緩慢。以此推測，腎陽虛患者疲勞、嗜睡與虛弱癥狀可能與氨基酸化合物消耗增加，核酸合成緩慢相關(guān)。

4 結(jié)語

代謝組學(xué)研究能夠全面、綜合、動態(tài)地檢測出生物體內(nèi)的代謝物質(zhì)變化，這些檢測特性與整體、辨證和恒動的中醫(yī)基礎(chǔ)理論具有一致性，能為中醫(yī)診療提供啟發(fā)性的思路和方法。利用代謝組學(xué)方法研究“證”引起的代謝物變化，為建立基于證型的客觀標(biāo)準(zhǔn)和物質(zhì)量化指標(biāo)提供了客觀依據(jù)。本研究篩選出的血清差異代謝標(biāo)志物，有利于腎陽虛P(yáng)OP發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究，為尋找中醫(yī)腎陽虛證的生物學(xué)本質(zhì)提供了理論依據(jù)。