王乾 孫攀 黃廷銳 黃晨 萬宏波 趙永見,3 鄔學(xué)群 王擁軍,3 施杞,3 唐德志,3*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理論與治法重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是老年人群高發(fā)骨折之一，尤其高發(fā)老年女性群體，其中髖部骨折的危害最大，所以又被骨科醫(yī)師形象地稱為“人生最后一次骨折”[1]。OPF的發(fā)生除了自身骨形成和骨吸收代謝紊亂外，跌倒是重要誘因[2]。有報(bào)道顯示，全球65歲以上老年人大約有35 %的比例會發(fā)生跌倒，而跌倒后發(fā)生骨折的概率更是接近15 %[3]。大量前瞻性研究更是證實(shí)肌少癥的發(fā)生與老年人跌倒和骨折的發(fā)生成正相關(guān)，肌少癥會引起骨骼肌功能的減退[4]。中醫(yī)學(xué)將肌肉與骨骼關(guān)系的失衡的現(xiàn)象稱之為“骨肉不相親”理論[5]，在論述治療骨折時(shí)強(qiáng)調(diào)筋骨并重，治療骨折的同時(shí)注重局部軟組織的保護(hù)。但是目前對于OPF患者肌肉病理狀態(tài)研究還不夠透徹，詳細(xì)了解OPF患者和非OPF患者肌肉病理狀態(tài)有助于我們深刻認(rèn)知OPF這種疾病。

組蛋白甲基化修飾作為組蛋白密碼的重要組成部分，深刻影響著表觀遺傳學(xué)的調(diào)控，是目前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[6]。SUV39H1是組蛋白甲基化酶，通過對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松緊密狀態(tài)的調(diào)控影響著目的基因的轉(zhuǎn)錄或沉默[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)SUV39H1可通過調(diào)控MYOD或輔助因子MEF2C調(diào)控抑制C2C12細(xì)胞的成肌分化。那么SUV39H1是否同樣會抑制OPF患者肌干細(xì)胞成骨分化呢？這需要對OPF患者肌肉的組蛋白甲基化情況進(jìn)行研究，而目前OPF患者與非OPF患者肌肉的組蛋白甲基化情況尚不明確。故本實(shí)驗(yàn)將OPF患者肌肉與非OPF患者肌肉進(jìn)行病理染色和RT-qPCR檢測，旨在探究OPF患者與非OPF患者肌肉病理狀態(tài)及組蛋白甲基化情況差異，從而為為OPF的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 一般資料

于2021年11月至2022年1月在上海中醫(yī)大學(xué)附屬龍華醫(yī)院骨傷科住院部分別招募6例OPF患者和非OPF患者。其中OPF組患者男性2例，女性4例。年齡 67～80歲，平均(73.2±5.4)歲；體重為42～75 kg，平均體重為(58.49±8.76)kg；受傷部位：左側(cè) 3例，右側(cè)3例；骨折類型：股骨粗隆間骨折3例，肱骨干骨折2例，橈骨遠(yuǎn)端骨折1例。非OPF組患者男性2例，女性4例。年齡 35～60歲，平均(42.6±6.0)歲；體重42～75 kg，平均(58.97±9.27)kg；受傷部位：左側(cè)3 例，右側(cè) 3例。骨折類型：股骨頸骨折1例，脛骨干骨折2例，腓骨骨折1例，蓋氏骨折2例。標(biāo)本獲取前已征得患者同意，并簽訂知情同意書。本研究已通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(倫理批件號：2020LCSY087號)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)：OPF患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①60歲≤年齡<80歲的男性、女性患者；②有車禍、扭傷或跌傷等外傷史；③臨床癥狀及體征：患側(cè)肢體壓痛、縱向叩擊痛呈現(xiàn)陽性，患肢可捫及骨擦音或骨擦感或不明顯，患肢多數(shù)有畸形。④影像學(xué)表現(xiàn)：X線或CT顯示明顯骨折征象；雙能X線顯示骨質(zhì)疏松(T≤-2.5)；⑤可耐受內(nèi)固定手術(shù)患者。非OPF患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①30歲≤年齡<60歲的男性、女性患者；②有車禍、扭傷或跌傷等外傷史；③臨床癥狀及體征：患側(cè)肢體壓痛、縱向叩擊痛呈現(xiàn)陽性，患肢可捫及骨擦音或骨擦感或不明顯，患肢多數(shù)有畸形。④影像學(xué)表現(xiàn)：X線或CT顯示明顯骨折征象；雙能X線顯示骨量正常(T值≥-1.0 )；⑤可耐受內(nèi)固定手術(shù)患者。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合上述OPF患者和非OPF患者納入標(biāo)準(zhǔn)者；開放性骨折有軟組織缺損或感染者；體質(zhì)較差難以進(jìn)行手術(shù)者；不愿意參加此研究者。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)所需OPF患者肌肉標(biāo)本和非OPF患者肌肉標(biāo)本均來自上海中醫(yī)大學(xué)附屬龍華醫(yī)院骨傷科，患者骨折手術(shù)內(nèi)固定時(shí)同時(shí)切取少量患側(cè)肌肉作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.4 主要試劑與儀器

H3K9me3、H3K9Ac抗體購自英國Abcam公司；HE試劑盒、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50×)均購自上海碧云天有限公司；MASSON試劑盒購自北京索萊寶有限公司；Tissure RNA Purification kit plus 、Color Reverse Transcription kit、2×Color SYBR Green qpcr master mix均購自美國 EZBioscience公司；兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋；PCR引物由華大基因生物有限公司合成，具體引物序列見表1。Histobath 攤片機(jī)、Histoplate 烘片機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、全自動石蠟包埋機(jī)、自動脫水機(jī)均采購德國Leica公司；BX51、BX42正置熒光顯微鏡日本Olympus公司。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.5 標(biāo)本獲取后處理

肌肉標(biāo)本在無菌手術(shù)室獲取出以后，分成兩塊：一塊立即放入液氮罐中保存；另一塊放入10 %的中性福爾馬林中固定，固定24 h以后流水沖洗3 h，隨后放入脫水機(jī)常規(guī)脫水，后續(xù)進(jìn)行石蠟包埋、切片。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1HE染色：標(biāo)本 60 ℃烤箱 30 min，脫蠟至水；蘇木精染液 2 min，后蒸餾水沖洗 1 min，鹽酸乙醇分化 5 s；氨水返藍(lán) 15 s，后蒸餾水沖洗 1 min，伊紅染液 2 min；蒸餾水沖洗 1 min，乙醇分化，二甲苯透明后樹膠封片。

1.6.2MASSON染色：標(biāo)本60 ℃烤箱 30 min，脫蠟至水；Weigert 鐵蘇木精染色10 min，酸性乙醇分化10 s，水洗；Masson 藍(lán)花液返藍(lán)4 min，水洗，蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色8 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸洗2 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺藍(lán)染色液浸染2 min，弱酸工作液洗1 min，95 %乙醇快速脫水；無水乙醇脫水3次，每次30 s；二甲苯透明3次，每次1 min，中性樹膠封片。

1.6.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR)：從液氮罐中取出肌肉標(biāo)本，根據(jù)EZBioscience 總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，測定RNA濃度并監(jiān)測提取RNA的質(zhì)量是否符合進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄的要求。將符合要求的RNA按照1 μg/20 μL 的體系采用EZBioscience反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，按照EZBioscience實(shí)時(shí)熒光定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-△△ct法計(jì)算SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株RUNX2、ALP、OPN、OCN、MYOD的mRNA相對表達(dá)量水平。表1為擴(kuò)增所需引物，PCR反應(yīng)條件為：第1步，95 ℃ 5 min；第2步，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.6.4免疫組化染色：標(biāo)本 60 ℃烤箱 30 min，脫蠟至水；標(biāo)本放入稀釋至1×的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，微波爐適當(dāng)時(shí)間抗原修復(fù)；加入適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS水洗3 min 3次；滴加適量一抗(H3K9me3、H3K9Ac)，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3 min空3次；滴加適量反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min 3次；滴加適量新鮮配置的DAB顯色液，室溫孵育5 min；自來水沖洗，蘇木精染色液孵育20 s，鹽酸乙醇分化，沖洗返藍(lán)；梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肌肉HE染色檢測結(jié)果

對兩組患者骨折部位肌肉的橫斷面和縱切面HE染色，可發(fā)現(xiàn)非OPF患者的肌肉更加緊實(shí)，OPF患者的肌肉較松弛。表明OPF患者易產(chǎn)生肌無力而跌倒。見圖1。

圖1 兩組患者肌肉橫切面(左)與縱切面(右)HE染色Fig.1 HE staining of transverse (left) and longitudinal (right) sections of muscle in both groups

2.2 肌肉MASSON染色檢測結(jié)果

對兩組患者骨折部位肌肉的橫斷面和縱切面MASSON染色，觀察膠原纖維在肌肉內(nèi)部的分布，可發(fā)現(xiàn)OPF患者的肌肉膠原纖維分布多于非OPF患者，這可能是OPF患者肌力下降的原因。

2.3 肌肉RT-qPCR檢測結(jié)果

通過實(shí)施定量PCR，我們檢測了OPF患者和非OPF患者骨折部位肌肉SUV39H1基因，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPF患者骨折部位肌肉SUV39H1表達(dá)水平較非OPF患者高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 兩組患者肌肉橫切面(左)與縱切面(右)MASSON染色Fig.2 MASSON staining of transverse (left) and longitudinal (right) sections of muscle in two groups of patients

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.4 骨折斷端肌肉H3K9Ac免疫組化染色檢測結(jié)果

對兩組患者骨折部位肌肉H3K9Ac免疫組化染色顯示，非OPF患者骨折部位肌肉H3K9Ac表達(dá)高于OPF患者，說明OPF患者肌肉組蛋白乙?；捷^低。

圖4 兩組患者肌肉H3K9Ac免疫組化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of muscle H3K9Ac in two groups of patients

2.5 骨折斷端肌肉H3K9me3免疫組化染色檢測結(jié)果

對兩組患者骨折部位肌肉H3K9me3免疫組化染色顯示，OPF患者骨折部位肌肉H3K9me3表達(dá)高于非OPF患者，說明OPF患者OPF患者肌肉組蛋白甲基化水平較高。

圖5 兩組患者肌肉H3K9me3免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining of muscle H3K9me3 in two groups of patients

3 討論

OPF是一種增齡性病理骨折，老年人是其易感人群。OPF的發(fā)生極其隱匿，呈漸進(jìn)性進(jìn)展，很容易被大家忽視，直至患者出現(xiàn)骨折結(jié)局，因此造成的危害極大。由于我國作為最大的老齡化國家，OPF人群基數(shù)龐大，該病的治療已引起社會廣泛關(guān)注[9]。目前針對OPF的治療主要是手術(shù)為主，外加抗骨質(zhì)疏松藥物治療。臨床上抗骨質(zhì)疏松的藥物根據(jù)其作用機(jī)制主要分為3類：促進(jìn)骨形成藥物、抑制骨吸收藥物及介于二者之間的多靶點(diǎn)藥物。鈣劑、維生素D及雙膦酸鹽類藥物是目前治療OP的臨床一線藥物，早期合理的聯(lián)合應(yīng)用可有效改善骨質(zhì)疏松狀況，降低OPF發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。但是長期服藥引起的不良反應(yīng)如胃腸道不良反應(yīng)、下頜骨壞死，增加乳腺癌、血栓等患病風(fēng)險(xiǎn)，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用[10-11]?？v觀OPF的診療，人們往往把治療的重心放在骨上，而對肌肉的關(guān)注程度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

大數(shù)據(jù)分析顯示，OPF的發(fā)生常合并眾多疾病，而肌少癥是值得我們關(guān)注的焦點(diǎn)[12]。肌肉和骨骼解剖上毗鄰，功能上互為影響。肌少癥引起的肌肉質(zhì)量下降是跌倒發(fā)生的易感因素，而跌倒又是OPF發(fā)生的直接誘因。對于肌肉和骨病理層面的探究，中醫(yī)典籍中早有論述?！端貑枴ゐ粽摗分赋觯骸捌鉄?，則胃干而渴，肌肉不仁，發(fā)為肉痿；腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，揭示了痿證的治療時(shí)應(yīng)注重調(diào)控脾腎及脾胃，豐富了痿證的治療理論[13]。中醫(yī)學(xué)治療骨折更是強(qiáng)調(diào)筋骨同治，在注重骨折治療的同時(shí)加強(qiáng)肌肉、肌腱、筋脈的保護(hù)[14]。本研究通過對OPF和非OPF患者骨折部位肌肉進(jìn)行HE染色、MASSON染色發(fā)現(xiàn)OPF患者肌肉較非OPF患者肌肉質(zhì)地更加松弛，膠原纖維含量明顯增多。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明了OPF患者肌力下降的原因，加深了對OPF疾病的認(rèn)識，同時(shí)也告誡我們在平時(shí)OPF的診療過程中要加強(qiáng)對肌少癥的調(diào)護(hù)，管理的時(shí)間點(diǎn)也不應(yīng)局限在治療時(shí)，而應(yīng)重視平時(shí)的干預(yù)?！肮侨獠幌嘤H”是OPF發(fā)生的重要誘因，因此在OPF的防治中，加強(qiáng)對肌肉的調(diào)護(hù)是未來OPF治療的一個(gè)發(fā)展方向。

組蛋白甲基化作為表觀遺傳修飾的一種，一般是指發(fā)生在H3或H4組蛋白氨基端殘基上的甲基化，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferases, HMTs)催化，作用是改變目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15]。組蛋白甲基化對基因轉(zhuǎn)錄程度的調(diào)控主要受發(fā)生甲基化的位點(diǎn)以及結(jié)合甲基數(shù)目決定[16]。SUV39H1屬于賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族的一員 ，主要通過催化第九位的賴氨酸殘基位點(diǎn)，發(fā)揮表觀遺傳修飾功能。對于組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(HKMT)，通常認(rèn)為H3K9的乙?；梢源龠M(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄，H3K9的甲基化對基因的轉(zhuǎn)錄的起抑制作用，并且H3K9的三甲基化是難以去除的[17]。目前針對SUV39H1的研究大多集中在腫瘤領(lǐng)域，相關(guān)研究顯示SUV39H1參與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[18-19]。對于OPF患者肌肉組蛋白甲基化狀態(tài)的研究相對匱乏。本研究我們通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)OPF患者肌肉SUV39H1基因相對表達(dá)量較非OPF患者高(P<0.001)。我們進(jìn)一步對OPF患者和非OPF患者肌肉進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)OPF患者較非OPF患者肌肉H3K9me3甲基化程度高、H3K9Ac乙酰化程度低。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富OPF患者表觀遺傳學(xué)理論，為我們后期治療提高了新思路。

綜上所述，本研究表明與非OPF患者肌肉相比，OPF患者肌肉更加松弛，膠原纖維含量增高，而這可能是由于肌肉組蛋白甲基化程度升高，乙?；档驮斐傻?。本研究以O(shè)PF患者肌肉與組蛋白甲基化的聯(lián)系為切入點(diǎn)，這為OPF的治療提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持，也提供了新的思路與方法。但是由于本實(shí)驗(yàn)存在樣本量少，組蛋白甲基化與肌肉病理直接機(jī)制尚未闡明，還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和完善。