楊文蕾，牛貴姍

1.青海省動植物檢疫站，青海西寧 810000；2.青海省藥品審評核查中心，青海西寧 810000

1 前言

青海省現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展過程中，畜產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工和消費過程始終伴隨著畜產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，主要表現(xiàn)為畜禽產(chǎn)品加工技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系相對落后、監(jiān)測預(yù)警能力薄弱、畜產(chǎn)品質(zhì)量安全保障體系不夠完善，致使畜產(chǎn)品中危害食品安全的問題依然突出，畜產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)與國際標(biāo)準(zhǔn)不對接、溯源體系不完備、畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測機構(gòu)發(fā)展不平衡、政府監(jiān)管部門的風(fēng)險預(yù)警能力薄弱、企業(yè)的自查能力較弱等，缺乏對畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的預(yù)判性，對問題產(chǎn)品的溯源性能力較弱[1]。

通過牦牛肉中萊克多巴胺和阿維菌素的快速檢測方法的研究，可有效推動我省牦牛肉食品安全監(jiān)控工作的開展。

2 研究方法

2.1 確定抗原

本研究所用的萊克多巴胺、阿維菌素抗原免疫原濃度分別為2、 4.7 μg/kg,包被原濃度分別為4.4、5.26 μg/kg。

2.2 確定單克隆抗體

單克隆抗體制備所用的免疫動物為6～8周齡的健康雌性Balb/c小鼠8只，共免疫6次，每次免疫間隔時間均為2周，選取血清效價高、IC50低的小鼠用于細(xì)胞融合，采用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，克隆完成后采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體[2]。免疫方案詳見表1。

表 1 小鼠免疫程序

選取效價高、抑制水平高的Balb/c小鼠用于細(xì)胞融合，采用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，克隆完成后采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體，采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水中的單克隆抗體。

采用ELISA和間接競爭ELISA方法測定抗體效價和IC50值，評價其靈敏度。單克隆抗體IC50結(jié)果分為別RAC 0.228 μg/kg和AV 0.751 μg/kg。

選取目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)類似物作為抑制劑，采用間接競爭ELISA測定各抑制物的IC50，計算其交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率（%）=IC50（目標(biāo)物）/IC50（結(jié)構(gòu)類似物）×100%。結(jié)果顯示萊克多巴胺、阿維菌素抗體與其他類似物標(biāo)準(zhǔn)品交叉反應(yīng)性好[2,3]。

2.3 確定抗體探針

采用200 nm熒光微球作2種抗體的標(biāo)記物，萊克多巴胺、阿維菌素抗體的用量（抗體濃度約2.0 mg/mL）分別為：10、15 μL，熒光微球標(biāo)記抗體復(fù)溶液配方為0.1 M Tris-HCl（pH7.0），含0.5% Tween-20、0.5%BSA、2%海 藻 糖 和0.02% Procline-300，熒光微球的噴量為3 μL/cm[4,5]。

2.4 確定抗原包被

選擇0.02 M PBS（pH7.4）做抗原包被液，分別將2種抗原稀釋2、4、8和16倍，根據(jù)試紙條熒光強度和抑制情況可知，2種檢測方法的最佳包被抗原稀釋倍數(shù)分別為：RAC1:4、AV1:8。

2.5 確定樣品墊

選用細(xì)玻纖（SB08）為樣品墊，樣品墊處理液配方為：0.02 M PB，含0.5% Tween-20，1%BSA，pH值7.5。

2.6 樣本前處理方法

2.6.1 萊克多巴胺

稱取2.00±0.05 g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中；加入4 mL提取劑A，充分渦動3 min至完全分散，4 000 g以上離心5 min；取0.6 mL中間層清液于離心管中，加入33 μL提取劑B，充分混勻，待檢。

2.6.2 阿維菌素

稱取1.00±0.02 g勻質(zhì)后的樣品于10 mL離心管中，并加入2 mL樣品提取液A，劇烈渦動1 min；加入4 mL提取液B，渦動3 min；4 000 g離心5 min，移取500 μL上層清液于5 mL離心管中，30 ℃氮氣吹干；向吹干的離心管中加入400 μL復(fù)溶液，搖勻，待檢[2,3]。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

取牦牛肉樣品各7份（每份不少于100 g），向其中添加萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液使其終濃度分別為：0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/kg；添加阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液使其終濃度分別為：0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/kg；充分混勻后，按照2.6進(jìn)行樣本提取。然后，按照EU-ICA方法進(jìn)行檢測。每個濃度重復(fù)檢測5次，取平均值，以添加樣本中靶標(biāo)物的終濃度為X軸，檢測線T熒光信號值與質(zhì)控線C熒光信號值的比值（T/C）為Y軸，用origin8.0做非線性擬合分析，形成四參數(shù)擬合曲線：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中，y為測定信號T/C的比值；x為待測物濃度；A，B，C和D是標(biāo)準(zhǔn)曲線的四個參數(shù)，并以IC20～I(xiàn)C80為方法的線性檢測范圍，通過測試，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下[4]。

萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.4015+(6.6439-0.4015)/[1+(x/0.9392)1.2497]，該 標(biāo) 準(zhǔn)曲線的線性區(qū)間（IC20～I(xiàn)C80）為0.483～4.347 μg/kg，線性相關(guān)性R2為0.9877。

阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.507+(6.658-0.507)/[1+(x/1.859)1.364]，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)間（IC20～I(xiàn)C80）為0.965～8.685 μg/kg，線 性相關(guān)性R2為0.9887。

2.8 牦牛肉中萊克多巴胺的檢測

2.8.1 定量限

分別測定使用EU-ICA免疫層析試紙測定儀器確證過的20個空白牦牛肉樣本的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），其平均值加上10倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為定量限（LOQ）。經(jīng)測定20個空白牦牛肉樣本測定值分別為0.180、0.193、0.232、0.214、0.183、0.164、0.194、0.183、0.151、0.273、0.176、0.166、0.244、0.183、0.202、0.175、0.169、0.178、0.179、0.175 μg/kg,計算平均值為0.191 μg/kg,標(biāo)準(zhǔn)差為0.030 μg/kg，最終結(jié)果表明萊克多巴胺藥物熒光定量快速檢測法在牦牛肉中定量限約為0.5 μg/kg。

2.8.2 準(zhǔn)確度和精密度的測定

對儀器確證過的空白牦牛肉樣本添加樣品進(jìn)行測定，樣品添加濃度分別為LOQ、2LOQ、8LOQ，每個濃度添加的樣本進(jìn)行6次平行試驗，計算樣品添加回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)[5]。

結(jié)果表明，所有樣品各添加濃度的回收率均在90.94～111.40%之間。各添加濃度的批內(nèi)變異系數(shù)低于10%、批間變異系數(shù)均低于15%。

2.9 阿維菌素的檢測

2.9.1 定量限

定量限（LOQ）確定同2.8.1，經(jīng)測定20個空白牦牛肉樣本測定值分別為1.077、1.858、1.314、1.054、0.660、2.135、2.690、2.786、2.309、0.509、2.295、1.407、0.904、2.903、2.782、1.760、1.298、0.522、1.014、2.673 μg/kg,平均值為0.191 μg/kg,標(biāo)準(zhǔn)差為0.030 μg/kg，最終結(jié)果表明萊克多巴胺藥物熒光定量快速檢測法在牦牛肉中定量限約為0.5 μg/kg，最終結(jié)果表明阿維菌素類藥物熒光定量快速檢測卡在牦牛肉中定量限約為10 μg/kg[5]。

2.9.2 準(zhǔn)確度和精密度的測定

測定方法同2.8.2，計算樣品添加回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。結(jié)果表明，所有樣品各添加濃度的回收率均在93.88～104.94%之間。各添加濃度的批內(nèi)變異系數(shù)低于10%、批間變異系數(shù)均低于15%[5]。

3 結(jié)論

本研究建立的萊克多巴胺和阿維菌素類藥物熒光定量快速檢測法檢測牦牛肉定量限分別為0.5、10 μg/kg，所有樣品各添加濃度的回收率均在90.94～111.40%、93.88～104.94%之 間。各 添加濃度的批內(nèi)變異系數(shù)低于10%、批間變異系數(shù)均低于15%[1,2]。