陳蘇維，艾雪言，劉 曄，葉文燕，馬雯慧

（安康學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學院，陜西 安康 725000）

HtrA2（Omi）基因位于人類染色體2p13.1，轉(zhuǎn)錄可生成2.1 kb和4.5 kb不同mRNA，但以前者為主[1]。HtrA2蛋白由458個氨基酸組成，含8個外顯子，在大部分的正常組織器官中都能表達[2-3]。Strauss等[4]對德國414例帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）患者和331名健康人的HtrA2基因進行測序發(fā)現(xiàn)，PD患者存在A141S（G421T）和G399S（G1195A）突變，這兩種突變體在多巴胺能細胞中過表達能夠誘發(fā)線粒體膜功能障礙和明顯蛋白酶失活，從而使細胞對應(yīng)激反應(yīng)更加敏感，因而導致細胞死亡。Kawamoto等[5]在PD患者大腦路易小體中也發(fā)現(xiàn)了HtrA2蛋白。其他學者的研究進一步證實了HtrA2基因在PD中的易感性以及與PD的相關(guān)性[6-7]。

HtrA2蛋白細胞外過表達可誘導細胞發(fā)生凋亡作用[8]。作為一種促細胞凋亡因子，HtrA2被發(fā)現(xiàn)在細胞和心肌衰老、急性肺炎和白血病發(fā)生等方面也發(fā)揮重要作用[9-12]。研究還發(fā)現(xiàn)，成熟HtrA2蛋白具有酶活性和分子伴侶功能，能夠降解細胞內(nèi)錯誤折疊的蛋白質(zhì)，在細胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時通過誘導caspase依賴性或caspase非依賴性細胞凋亡發(fā)揮其細胞保護作用[13-14]。

盤基網(wǎng)柄菌（Dictyostelium discoideum）隸屬原生生物界變形蟲門（Amoeba）黏菌綱（Mycetozoa）[15]，屬于單細胞真核生物，是研究細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞發(fā)育和形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)退行性疾病機制的模式生物[16-18]。盤基網(wǎng)柄菌在營養(yǎng)豐富時以二分裂方式繁殖后代；缺乏營養(yǎng)時，單細胞則經(jīng)歷細胞聚集、細胞丘、蛞蝓體和子實體4個階段形成多細胞[19]。盤基網(wǎng)柄菌單倍體基因組編碼約12 500種蛋白質(zhì)，其中許多種蛋白質(zhì)與哺乳動物直系同源，33種蛋白質(zhì)與人類某些疾病相關(guān)蛋白質(zhì)直系同源[20]，因而盤基網(wǎng)柄菌被作為模式生物廣泛用于人類腫瘤、帕金森病和白血病等相關(guān)研究。

本研究通過同源序列分析，得到人類HtrA2的盤基網(wǎng)柄菌同源基因，對其進行了PCR克隆和生物信息學分析，以期為今后構(gòu)建盤基網(wǎng)柄菌HtrA2重組真核表達載體、獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)化株、進行基因型和表現(xiàn)型相應(yīng)性分析、構(gòu)建HtrA2相關(guān)型疾病的盤基網(wǎng)柄菌模型等奠定基礎(chǔ)。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

實驗所用質(zhì)粒載體為pUC18，實驗菌株為大腸桿菌DH5α和盤基網(wǎng)柄菌AX2。

1.2 研究方法

1.2.1 盤基網(wǎng)柄菌總基因組DNA提取

從生長克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）的標準培養(yǎng)基上收集約107個盤基網(wǎng)柄菌細胞，2500 r/min室溫離心30 s，將收集的細胞用鹽溶液沖洗4次去除殘留的克雷伯氏菌，用1 ml DNAzol 4℃放置30 min對細胞進行裂解。裂解液室溫12200 r/min離心10 min，然后取上清液用0.5 ml 100%酒精進行沉淀，8600 r/min離心5 min。將沉淀所得盤基網(wǎng)柄菌總基因組DNA用1 ml 70%酒精洗滌3次后懸浮于100 μl 8 mM氫氧化鈉溶液4℃貯存或立即使用。

1.2.2 PCR擴增盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因

參照Dictybase公布的基因序列，運用Primer 5.0軟件設(shè)計HtrA2特異性引物（見表1），并由生工生物（上海）股份有限公司進行合成。

表1 擴增盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因的上、下游引物序列

以提取的盤基網(wǎng)柄菌基因組DNA為模板，擴增HtrA2基因全長序列，100 μl PCR反應(yīng)物體系包括：盤基網(wǎng)柄菌總基因組DNA 2 μl，雙蒸水78 μl，PCR 緩沖液 （10 x） 10 μl，Mgcl2 （50 mM） 5 μl，dNTP（10 mM）混合物2 μl，上、下游引物（10μM）各1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl。PCR擴增反應(yīng)條件和參數(shù)為：（1）95℃模板變性5 min；（2）95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min為1次，共循環(huán)35次；（3）72℃延伸10 min。

1.2.3HtrA2基因和pUC18質(zhì)粒的限制性酶切和連接

利用限制性內(nèi)切酶EcoR I對擴增的盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因和pUC18質(zhì)粒進行酶切，10 μl酶切反應(yīng)體系為：PCR緩沖液（10 x）1 μl，HtrA2或pUC18 質(zhì)粒 （0.2～1 μg/μl） 2 μl，EcoRI 1μl，雙蒸水6 μl。將該反應(yīng)體系37℃溫育1.5 h，然后加入硼酸鈉電泳顯示劑（SBE）使之失活。酶切結(jié)果經(jīng)電泳檢測后，利用PureLinkTMQuick Gel Extraction Kit對HtrA2和pUC18進行抽提和純化。用15 U熱敏堿性磷酸酶（TSAP）37℃處理1 μg pUC18質(zhì)粒DNA 30 min以去除質(zhì)粒5'端磷酸，再通過微量滲析去除多余電解液以避免質(zhì)粒自身重新環(huán)化。最后HtrA2和質(zhì)粒pUC18以7∶1的比例按下述反應(yīng)體系進行連接：HtrA2基因 22 μl，T4 連接酶 2 μl，T4連接緩沖液（10x）3 μl，pUC18質(zhì)粒3 μl，16 ℃過夜進行連接反應(yīng)，所形成產(chǎn)物為pUC18-HtrA2重組載體。

1.2.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化株的獲取和篩選

利用電穿孔法將制備的重組載體pUC18-HtrA2轉(zhuǎn)入電感受態(tài)E.coliDH5α細胞。對所制備的細胞液進行不同濃度稀釋，然后接種到含100 μg/ml阿莫西林的LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，再利用藍-白斑法對轉(zhuǎn)化株進行篩選。

1.2.5 大腸桿菌重組載體的提取、純化及測序

利用堿裂解法將所篩選轉(zhuǎn)化株中的重組載體pUC18-HtrA2進行抽提，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和凝膠電泳檢測后，參考PureLinkTMHiPure Plasmid Filter Purification Kit和PureLinkTMHiPure Precipita‐tor Module的使用方法進行大規(guī)模重組表達載體的提取和純化。

盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因的測序由生工生物（上海）股份有限公司完成。

1.2.6 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因的生物信息學分析

利用人類帕金森病相關(guān)HtrA2基因的氨基酸序列在 NCBI（National Center for Biotechnnology In‐formation）網(wǎng)站進行BLAST比對分析，查詢對應(yīng)的盤基網(wǎng)柄菌同源HtrA2基因并構(gòu)建盤基網(wǎng)柄菌HtrA2系統(tǒng)進化樹；利用Protparam軟件分析盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的理化性質(zhì)；利用TMHMM和Sig‐nalP 5.0 Server軟件分別預(yù)測HtrA2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽；利用SMART軟件預(yù)測HtrA2蛋白的結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件分別預(yù)測HtrA2蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人類HtrA2基因的盤基網(wǎng)柄菌同源基因

為了用盤基網(wǎng)柄菌作為模式生物研究人類帕金森病相關(guān)HtrA2基因的功能，利用人類HtrA2蛋白的編碼氨基酸在Dictybase上查詢盤基網(wǎng)柄菌同源HtrA2蛋白。查詢結(jié)果表明，其同源蛋白完全相同的氨基酸序列占28%，極為相似的占46%，而兩者之間的差異占8%（見圖1）。

圖1 人類HtrA2基因和盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白氨基酸序列的BLAST對比

2.2 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因的PCR克隆結(jié)果

利用提取的盤基網(wǎng)柄菌總基因組DNA作為模板，擴增HtrA2基因全長序列，凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)HtrA2基因全長約2 000 bp（見圖2）。

圖2 HtrA2基因的PCR克隆結(jié)果

2.3 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因重組載體的酶切及測序

將PCR擴增產(chǎn)生的盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因通過酶切插入大腸桿菌質(zhì)粒pUC18，獲得重組載體pUC18-HtrA2。雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)：pUC18-HtrA2中插入的HtrA2基因大小和方向均正確（見圖3）。

圖3 pUC18-HtrA2雙酶切鑒定結(jié)果

測序結(jié)果表明，盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因大小為2 023 bp，含1個內(nèi)含子（496～574 bp）。

2.4 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因的核苷酸同源序列比對

將測序所得的盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因序列在NCBI網(wǎng)站中進行BLAST對比，結(jié)果見下頁圖4。圖4顯示，本研究所用盤基網(wǎng)柄菌AX2菌株的HtrA2核苷酸序列與其同種AX4菌株的完全相同，與其同屬不同種D.purpureum和D.fasciculatum的相似度分別為82.48%和75.97%，與其不同種屬Weissella的相似度為95.12%，而與藍細菌屬3種不同菌株的相似度都為88.68%。

圖4 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因核苷酸序列與參考菌株同源序列比對分析

2.5 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的系統(tǒng)進化分析

通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，結(jié)果表明，盤基網(wǎng)柄菌屬（Dictyostelium）中D.discoideum種內(nèi)兩個菌株AX2和AX4屬于同源（見下頁圖5）。

圖5 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.6 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的理化性質(zhì)分析

利用Protparam軟件分析盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，HtrA2蛋白的分子量為72.17 kD，分子式為C3180H5047N895O996S13，理論等電點為5.90，含有257個非極性氨基酸（A、F、V、L、I、P、W和M）和390個極性氨基酸，其中包括66個酸性氨基酸（D和E）、70個堿性氨基酸（H、K和R）和254個非解離的極性氨基酸（N、C、Q、G、S、T和Y）。帶負電荷的殘基總數(shù)為66個，帶正電荷的殘基總數(shù)為58個。不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）為39.03，表明盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白相對穩(wěn)定。其脂溶指數(shù)（Aliphatic index）為94.51，總疏水性平均值（Grand average of hydro‐pathicity，GRAVY）為-0.343。

2.7 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的跨膜區(qū)、信號肽分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白跨膜區(qū)及信號肽研究分析結(jié)果表明HtrA2蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，且含有信號肽識別序列。利用SMART軟件對HtrA2蛋白的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果表明，HtrA2蛋白存在明顯的結(jié)構(gòu)域，比如PDZ結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由103個氨基酸構(gòu)成（350-453 aa）。

2.8 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白含α-螺旋142個，占21.95%；β-轉(zhuǎn)角41個，占6.33%；無規(guī)卷曲302個，占46.68%；延伸鏈162個，占25.04%（見圖6）。SWISS-MODEL檢測結(jié)果顯示了盤基網(wǎng)柄菌的立體空間結(jié)構(gòu)模型如下頁圖7所示。

圖6 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖7 盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究對盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因進行了克隆與生物信息學分析，結(jié)果表明，盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因全長2 023 bp，含1個內(nèi)含子，共編碼647個氨基酸。其核苷酸序列盤基網(wǎng)柄菌種內(nèi)不同菌株之間完全相同，但不同屬或種之間存在一定的差異性。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)顯示，盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的分子量約為72.17 kd，其理論等電點為5.90，含390個非極性氨基酸和257個極性氨基酸，有明顯的結(jié)構(gòu)域，含信號肽識別序列且存在跨膜結(jié)構(gòu)。HtrA2蛋白含α-螺旋142個，β-轉(zhuǎn)角41個，無規(guī)卷曲302個，延伸鏈162個。

3.2 討論

其他研究發(fā)現(xiàn)，人類HtrA2蛋白位于線粒體內(nèi)膜間隙[21]。本研究利用軟件進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，且其N端含信號肽識別序列，這進一步驗證了HtrA2蛋白屬于線粒體蛋白，因此具有跨線粒體膜序列和線粒體靶向基因序列。

HtrA2可能通過其絲氨酸水解酶活性在帕金森病的發(fā)生中起保護作用，而且通過對蛋白酶結(jié)構(gòu)域S142和PDZ結(jié)構(gòu)域S400進行磷酸化，其水解酶活性大大增強[22]。本研究發(fā)現(xiàn)盤基網(wǎng)柄菌HtrA2蛋白的空間結(jié)構(gòu)除PDZ結(jié)構(gòu)域外，還存在絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，HtrA2通過對該結(jié)構(gòu)域進行修飾或與其他結(jié)構(gòu)域協(xié)作完成其生物學功能。

本研究克隆了盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因，并對其進行了序列測定和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)域、信號肽和空間結(jié)構(gòu)預(yù)測。今后可以在此研究基礎(chǔ)上進一步構(gòu)建盤基網(wǎng)柄菌HtrA2基因的真核表達載體、在氧化和正常條件下通過控制盤基網(wǎng)柄菌細胞內(nèi)HtrA2的表達水平，觀察及測定盤基網(wǎng)柄菌的異常表現(xiàn)型，并建立其相關(guān)性、對盤基網(wǎng)柄菌HtrA2的催化位點進行突變，并進行對照分析，研究HtrA2對盤基網(wǎng)柄菌細胞進行保護的可能機制，從而為建立帕金森病相關(guān)基因HtrA2的盤基網(wǎng)柄菌模型奠定基礎(chǔ)。