劉 芹

（安康學(xué)院 體育學(xué)院，陜西 安康 725000）

生命活動(dòng)、體育運(yùn)動(dòng)、競(jìng)技運(yùn)動(dòng)和體力活動(dòng)等都需要心臟提供能量和氧氣，心臟工作的能量由線粒體供給。硒能夠保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)完整[1-3]。茶多糖具有抗疲勞、抗氧化的功能，文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，鮮有學(xué)者研究硒與茶多糖維護(hù)心肌細(xì)胞正常功能的機(jī)制。富硒綠茶不僅含有微量元素硒，還含有茶糖蛋白、茶多酚等多種有機(jī)物。本文選用安康紫陽天然富硒綠茶，從中提取純化富硒茶（糖）蛋白（Se-rich tea glycoprotein，STG），然后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究STG對(duì)心肌細(xì)胞線粒體抗氧化能力和增強(qiáng)能量代謝能力的影響機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，共24只，體重200～230 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度25±5℃，相對(duì)濕度42%～68%。大鼠與飼料購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 塑造實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)大鼠7天后，以速度15 m/min、5 min/d進(jìn)行為期3天的訓(xùn)練，篩選適合跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組：安靜對(duì)照組（quiet control group）、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組（exercise control group）、運(yùn)動(dòng)加STG組（Exercise plus-Se-rich tea glycoprotein group）（每組個(gè)數(shù)均為8只，即n=8）。

動(dòng)物運(yùn)動(dòng)模型塑造為：每天訓(xùn)練前以15 m/min的速度做適應(yīng)運(yùn)動(dòng)5min后正式訓(xùn)練，訓(xùn)練模型基于Bedford[x]模型結(jié)合實(shí)際略加調(diào)整，為期8 w。1～4 w：速度=15 m/min（坡度分別為0%，5%，5%，5%），運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度VO2max分別為52，58，58ml·kg·min-1；5～8w：速度=27 m/min（坡度分別為5%，5%，10%，10%），運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度VO2max分別為74，74，81 ml·kg·min-1。力竭判斷指標(biāo)為動(dòng)物跟不上預(yù)定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶拖達(dá)30秒，毛刷驅(qū)趕無效[4-5]。表現(xiàn)為呼吸深急、幅度大，呈疲勞表現(xiàn)，俯臥位，低頭，刺激后依然不能繼續(xù)運(yùn)動(dòng)。

1.2.2 STG提取與給藥方法

STG提取。（茶）葉為陜西省紫陽縣富硒綠茶，STG的提取參照文獻(xiàn)[6]241中的方法進(jìn)行。STG中多糖含量為52.34%，蛋白質(zhì)含量為3.67%，硒含量為2.34 μg/g。

給藥方法。每次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，對(duì)運(yùn)動(dòng)加STG組大鼠進(jìn)行STG灌胃，劑量為100 mg/kg/d[7]，安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水，實(shí)驗(yàn)為期8周。

1.2.3 取材及樣品制備

第8周最后1天，在運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)加STG組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后記錄力竭時(shí)間，對(duì)安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)加STG組大鼠均用20%烏拉坦（0.5 ml/kg體重）腹腔麻醉后，迅速取心臟置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，再用濾紙吸干后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

線粒體制備。按心肌/緩沖液1∶10的比例將心肌放入預(yù)冷的緩沖液中剪碎勻漿，將勻漿液離心（3000 r/min，10 min），棄去沉淀，上清液再次離心（10000 r/min，10 min），得沉淀，用緩沖液將所得沉淀洗兩次，加入一定量緩沖液制備成線粒體懸液。

1.3 測(cè)試指標(biāo)

1.3.1 大鼠體重

用TCS-2000A型電子秤于每周訓(xùn)練后測(cè)定大鼠體重。

1.3.2 細(xì)胞抗氧化指標(biāo)

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxide，GSH-Px）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、過 氧 化 氫 （hydrogen peroxide，H2O2）。

1.3.3 線粒體功能指標(biāo)

ATP 酶 （aenosine triphosphatease，ATPase）（Na+，K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）、羥脂酰CoA脫氫酶（hydroxyacyl-CoA dehydroge‐nase，HCD）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydroge‐nase，SDH）、細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome-oxydase，CCO）。

1.3.4 蛋白質(zhì)定量

上述指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按照說明書規(guī)定的方法進(jìn)行操作[8]111。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的One-way ANOVA功能進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，常規(guī)方法計(jì)算均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），進(jìn)行t檢驗(yàn)，確定差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)過程中大鼠體重變化

體重?cái)?shù)據(jù)直接反應(yīng)大鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)的適應(yīng)情況以及實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠個(gè)體發(fā)育的影響。每周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的星期天測(cè)定大鼠體重，體重情況見圖1。圖1測(cè)試數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)期間三個(gè)組的大鼠骨骼、肌肉發(fā)育均良好，沒有肥胖的個(gè)體。

圖1 STG及跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體重的影響Figure1 Effect of STG and treadmill training on body weight of experimental rats

2.2 大鼠心肌細(xì)胞線粒體的抗氧化能力

8周有氧力竭疲勞訓(xùn)練后，檢測(cè)STG影響大鼠心肌細(xì)胞線粒體的抗氧化能力，結(jié)果如表1所示。

表1 各組大鼠心肌線粒體抗氧化能力Table1 Antioxidant capacity of myocardial mitochondria of rats in each group

由表1可知，與安靜組比較，運(yùn)動(dòng)組的SOD活性具有顯著性差異，GSH-Px、CAT活性具有非常顯著性差異；運(yùn)動(dòng)加STG組的SOD、GSH-Px、CAT活性具有顯著性差異。與運(yùn)動(dòng)組相對(duì)比，運(yùn)動(dòng)加STG組的SOD、GSH-Px活性具有顯著性差異，CAT活性具有非常顯著性差異。提示運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌線粒體GSH-Px、CAT活性的影響更大，GSH-Px的主要組成成分為硒半胱氨酸，可以反映大鼠體內(nèi)硒水平高低。GSH-Px促進(jìn)過氧化氫與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG）[9]。運(yùn)動(dòng)加STG能夠提高大鼠體內(nèi)硒含量，從而提高GSH-Px活性，能夠維護(hù)心肌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及功能的完整[10]。CAT在體內(nèi)可催化H2O2轉(zhuǎn)化為無毒無害的O2、H2O，不至于生成有害的OH-。

與安靜組對(duì)照發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組和運(yùn)動(dòng)加STG組的MDA、H2O2值具有非常顯著性差異。與運(yùn)動(dòng)組對(duì)照發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)加STG組的MDA、H2O2值具有非常顯著性差異。心臟是全身血液循環(huán)的能量來源，心臟對(duì)能量供應(yīng)要求較高。在大強(qiáng)度耐力性運(yùn)動(dòng)過程中心臟細(xì)胞能量的供應(yīng)主要由線粒體通過脂肪酸β-氧化來提供能量。不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生自由基[8]113以及MDA，MDA具有細(xì)胞毒性。MDA含量較運(yùn)動(dòng)組降低也說明了STG增強(qiáng)了心臟線粒體抗氧化功能，降低了細(xì)胞內(nèi)自由基生成，從而使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化減少[11]。

2.3 STG對(duì)大鼠心肌線粒體ATPase活性的影響

STG對(duì)大鼠心肌線粒體Na+，K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影響見表2。

表2 各組大鼠心肌ATPase活性Table 2 Myocardial ATPase activity of rats in each group

從表2可以看出，與安靜組比較，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組的心肌線粒體ATPase活性有非常顯著性差異，這與運(yùn)動(dòng)中能量代謝有關(guān)系；運(yùn)動(dòng)加STG組的ATPase活性具有顯著性差異。與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組比較，運(yùn)動(dòng)加STG組的ATPase活性具有顯著性差異。說明STG提高了運(yùn)動(dòng)過程中大鼠心肌線粒體的能量代謝酶活性，進(jìn)而能夠提高運(yùn)動(dòng)中心肌細(xì)胞的能量供應(yīng)。

2.4 STG對(duì)線粒體氧化酶活性的影響

STG對(duì)線粒體氧化酶活性的影響結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠心肌HCA、SDH、CCO 活性Table 3 myocardial HCA，SDH and CCO activities of rats in each group

從表3可以看出，與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組的HCD、CCO，及運(yùn)動(dòng)加STG組的HCD、SDH、CCO均具有顯著性差異。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組SDH具有非常顯著性差異。與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)加STG組的HCD、CCO具有顯著性差異，SDH具有非常顯著性差異。這應(yīng)該是與三羧酸循環(huán)效率提高有關(guān)系。

2.5 實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)能力提升對(duì)比

大強(qiáng)度訓(xùn)練至疲勞的時(shí)間反映出各組大鼠運(yùn)動(dòng)能力的水平，測(cè)試結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠的運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間是94.33±12.65 min，運(yùn)動(dòng)加STG組大鼠的運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間是126.72±12.87 min，力竭延緩率為34.34%（P<0.01）。

3 討論

3.1 STG 功能活性

本實(shí)驗(yàn)使用的STG是參照池愛平等人的提純方法從安康紫陽富硒綠茶提取得到的。池愛平等人發(fā)現(xiàn)，STG的活性成分包括糖、結(jié)合蛋白和硒，并且為含硒蛋白多糖，研究結(jié)構(gòu)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)富硒茶多糖本身有其特定的活性功能，但有待于進(jìn)一步研究[6]243。而本研究提取的STG具有抗氧化功能，STG能夠提高線粒體ATP酶的活性，增強(qiáng)大鼠心臟生物氧化酶的活性，提高能量代謝的效率，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力。

硒、綠茶和糖蛋白已經(jīng)被廣大學(xué)者證實(shí)具有抗氧化功能[12]，但是不同抗氧化劑對(duì)大鼠不同組織的抗氧化效果差別較大[13]。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)加STG組大鼠心肌的GSH-Px活性相較于安靜組和單純運(yùn)動(dòng)組都具有顯著性差異，說明硒提高了GSHPx的活性；STG對(duì)此組心肌線粒體 HCD、CCO活性的提高與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠（P<0.05）相比較為明顯，提示 STG保護(hù)了線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的完整。因此，本研究中，STG的活性既表現(xiàn)為金屬離子硒的活性，也表現(xiàn)為蛋白多糖的活性。

其他研究表明，富硒綠茶含有的茶多糖成分的抗氧化活性明顯優(yōu)于普通綠茶[14]。本研究提取的STG為天然富硒茶葉所含的硒和糖蛋白。胡秋輝等通過研究天然富硒茶葉的吸收率發(fā)現(xiàn)大鼠對(duì)天然硒的吸收利用率為68.05%～70.40%，而Na2SeO3的吸收利用率為65%，故天然富硒茶優(yōu)勝人工富硒茶葉。同時(shí)天然硒與人工硒提高GSH-Px活性具有顯著性差異[15]。本研究顯示，陜西省紫陽縣天然富硒綠茶對(duì)大鼠心臟細(xì)胞線粒體的GSH-Px活性（p<0.05）影響相較于安靜和運(yùn)動(dòng)組大鼠都具有顯著性差異，細(xì)胞內(nèi)MDA產(chǎn)生量非常顯著性降低（p<0.01），天然硒的抗氧化功能比亞硒酸鈉強(qiáng)[16]。

3.2 STG提高心臟細(xì)胞線粒體抗氧化能力機(jī)制

表1、2顯示，安靜大鼠的 SOD、GSH-Px、CAT活性都比單純運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)加 STG組大鼠的活性高，提示運(yùn)動(dòng)過程中抗氧化酶活性降低，心臟細(xì)胞線粒體會(huì)產(chǎn)生一定的氧化損傷。運(yùn)動(dòng)加STG組大鼠體內(nèi) SOD、GSH-Px、CAT活性均優(yōu)勝單純運(yùn)動(dòng)組大鼠，提示在相同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間下，STG能夠提高心臟細(xì)胞線粒體抗氧化酶活性，降低心肌線粒體的氧化損傷。

線粒體工作的穩(wěn)定性受其功能穩(wěn)定性影響，而功能穩(wěn)定性受其代謝影響。在氧化過程中有部分電子漏出，在細(xì)胞內(nèi)生成活性氧（ROS）。ROS對(duì)線粒體產(chǎn)生過氧化損傷，STG則通過兩個(gè)方面提高心臟細(xì)胞線粒體生物氧化能力，一是提高SOD、GSH-Px、CAT三種還原酶活性，從而提高線粒體的抗氧化能力，保證線粒體功能的穩(wěn)定。二是降低氧化反應(yīng)產(chǎn)物 MAD、H2O2的水平，減少線粒體膜通透性的變化，線粒體膜電位處于穩(wěn)定狀態(tài)，減少線粒體內(nèi)的 cytochrome C被釋放到胞質(zhì)中，cy‐tochrome C可以激活胞質(zhì)中的 caspase凋亡反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。從而降低線粒體和細(xì)胞損傷，提高心肌線粒體細(xì)胞有氧氧化能力。

3.3 STG 提高心臟線粒體能量代謝效率機(jī)制

心臟在生命活動(dòng)中有著舉足輕重的作用，線粒體是心臟能量供應(yīng)過程中主要的能量來源，線粒體能量合成受多種因素影響，如呼吸鏈抑制、相關(guān)抗氧化酶活性下降和線粒體膜通透性（mPTP）增加等，使線粒體膜生物電電位降低及ATP產(chǎn)生障礙，引起胞內(nèi)ATP水平下降。心臟能量來源主要為線粒體的有氧氧化過程，并且線粒體作為有氧氧化的場(chǎng)所大約消耗細(xì)胞85%～90%的氧[18]。

能量代謝受到氧化還原反應(yīng)中漏出電子形成的ROS影響，線粒體是產(chǎn)生內(nèi)源性ROS的主要場(chǎng)所[19]，也是ROS損傷的主要靶點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生量超出機(jī)體對(duì)其清除能力時(shí)，細(xì)胞線粒體發(fā)生損傷。主要表現(xiàn)為線粒體膜磷脂被氧化及電子傳遞鏈被破壞，從而影響 cytochrome C氧化酶和ATP合成酶活性，實(shí)驗(yàn)研究表明，STG對(duì)提高大鼠 ATP酶活性有顯著性差異[20]。STG通過增強(qiáng)氧化還原酶活性來增強(qiáng)線粒體在能量代謝中的工作效率。

綜上，STG增強(qiáng)心臟細(xì)胞線粒體能量供應(yīng)效率的機(jī)制為：首先是提高心臟線粒體抗氧化的能力，從而增強(qiáng)心臟細(xì)胞的正常工作能力；其次是提高線粒體ATP酶和脂肪酸β-氧化酶和線粒體氧化酶的活性，加快物質(zhì)代謝從而提高能量代謝效率。STG提高大鼠心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ATP酶活性，進(jìn)而提高心肌細(xì)胞線粒體能量代謝效率。SDH是唯一嵌入到線粒體內(nèi)膜的酶，STG增強(qiáng)SDH活性的同時(shí)也保護(hù)了線粒體內(nèi)膜的完整。其他研究也表明，線粒體膜、細(xì)胞核膜在低硒時(shí)會(huì)發(fā)生磷脂過氧化損傷，會(huì)產(chǎn)生心臟細(xì)胞線粒體傷害[21]，這也進(jìn)一步說明硒具有保護(hù)線粒體膜、細(xì)胞核膜的功能。

4 結(jié)論

STG通過提高心臟細(xì)胞線粒體抗氧化酶活性，降低細(xì)胞氧化副產(chǎn)物來提高心臟抗氧化能力，機(jī)制與STG保護(hù)心臟細(xì)胞線粒體構(gòu)造以及功能完整性有關(guān)系。因此，STG具有增強(qiáng)心肌細(xì)胞線粒體抗氧化能力及提高能量代謝標(biāo)志酶活性的功能。