蘇建如， 彭艷*， 江偉， 韋杰， 欒春光， 楊成， 鄧文楷， 鄧四情

(1. 貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025; 2.四川省宜賓竹海酒業(yè)有限公司， 宜賓 644304; 3.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院國(guó)家酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心， 北京 100015)

土壤微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分，極易受到外界環(huán)境影響，在林地生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用[1]。林地植被覆蓋和植被類型對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有重要影響[2]，林地植物群落多樣性關(guān)系到根際土壤提供微生物代謝的碳源種類的豐富度，決定著土壤微生物群落多樣性[3]。竹林植被單一，研究發(fā)現(xiàn)其林下土壤細(xì)菌主要來(lái)自變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)[4-5]，其中綠彎菌門是竹林土壤的特有優(yōu)勢(shì)菌[6]。對(duì)毛竹林的研究顯示，竹林非根際土壤細(xì)菌數(shù)量低于其他林地植物[7-8]，以酸桿菌門和變形菌門為主[9]，主要包括嗜糖假單胞菌Zoogloea、Pelomonas、陶厄氏菌屬Thauera、根瘤菌屬Rhizobium等[10]；而雷竹林則以綠彎菌門、酸桿菌門和變形菌門為主[11]，即不同種類的竹林土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)和多樣性存在較大差異。

活竹酒是將基酒注入毛竹幼竹竹腔內(nèi)自然生長(zhǎng)三到五年所得，竹子活化了基酒中的甲醇、雜醇油等雜質(zhì)，竹酒發(fā)酵過(guò)程中吸收了竹體中對(duì)人體有益的黃酮等元素，決定了竹腔內(nèi)酒體的二次形成過(guò)程和酒體品質(zhì)的高低[12]?；谱⑷胫耋w、發(fā)酵和取酒等過(guò)程會(huì)導(dǎo)致基酒滲入林下土壤，改變林下土壤尤其是根際土壤環(huán)境，進(jìn)而影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。利用竹林原位釀酒是一個(gè)很有商業(yè)價(jià)值的行為，目前鮮見(jiàn)對(duì)竹酒釀造區(qū)這種特殊環(huán)境中的竹林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的報(bào)道，因此，現(xiàn)圍繞這種活動(dòng)對(duì)竹酒釀造區(qū)這種特殊竹林環(huán)境中的土壤細(xì)菌群落的研究，既能豐富特殊環(huán)境或極端環(huán)境下土壤微生物分布數(shù)據(jù)資料，還能為竹酒企業(yè)酒體形成和發(fā)酵過(guò)程的質(zhì)量控制提供環(huán)境數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 采樣區(qū)概況

采樣區(qū)位于素有“天然氧吧”之稱的“中國(guó)最美十大森林”、國(guó)家AAAA級(jí)風(fēng)景區(qū)——四川宜賓長(zhǎng)寧縣蜀南竹海竹酒釀酒生態(tài)園。長(zhǎng)寧縣位于104°44′22″E～105°03′30″E，28°15′18″N～28°47′48″N，地勢(shì)南高北低，南北長(zhǎng)約60 km，東西寬30 km，海拔245.9～1 408.5 m，森林覆蓋率62.8%，竹林是境內(nèi)植物一大特色,竹類品種中以楠竹、慈竹、硬頭黃竹、苦竹、斑竹為主產(chǎn)。長(zhǎng)寧縣屬中亞熱帶濕潤(rùn)性季風(fēng)氣候，溫暖濕潤(rùn)，雨熱同季，年均氣溫18.3 ℃，年均降雨量1 141.7 mm，日照時(shí)數(shù)987.6 h，年無(wú)霜期357 d。竹酒釀酒生態(tài)園占地150畝(1畝=667 m2)，園內(nèi)有兩萬(wàn)余棵竹，園區(qū)綠化率68%，其竹海酒傳統(tǒng)釀造技藝在2018年獲得“長(zhǎng)寧縣非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”稱號(hào)，年產(chǎn)優(yōu)質(zhì)竹海酒超過(guò)6 000 t。

1.2 土壤樣本

以竹酒工業(yè)園區(qū)竹酒竹林幾何中心為核心，在竹林核心區(qū)(J1)、非竹林區(qū)(J2)和竹林邊緣區(qū)(J3)選取生境因子基本一致的樣點(diǎn)，以五點(diǎn)采樣法采集距竹根50～60 cm的0～15 cm表層土壤，去除土壤中的石頭、樹(shù)根等雜物，充分混勻后裝入無(wú)菌采樣袋中，置于-85 ℃保存用于高通量測(cè)序。

1.3 高通量測(cè)序及生物學(xué)信息統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 土壤微生物宏基因組提取及檢測(cè)

利用安倍 (MP)的土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil)提取土壤微生物元基因組，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)元基因組完整性后，用微量核酸測(cè)量?jī)xNanoDrop和Qbit對(duì)其DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，OD260/280=1.8，最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的完整性。

1.3.2 構(gòu)建元基因組文庫(kù)

以細(xì)菌16S V4區(qū)(引物為515F和806R)正向、反向引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(forward 、reverse primer PCR)擴(kuò)增得到的元基因組為模板，使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)，不同樣本通過(guò)反向引物的barcode加以區(qū)別。反應(yīng)體系為50 μL，包括正反向引物各0.4 μmol/L，200 μmol/L的4種dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，1U的Taq DNA聚合酶(Kapa biosystems，Boston，US)。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 6 min，共22個(gè)循環(huán)：95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，并用QIAGEN MinElute?gel extraction kit (Cat.no. 28604, USA)回收試劑盒回收目的條帶。對(duì)每個(gè)文庫(kù)都進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)，包括NanoDrop ND1000 的濃度檢測(cè)(Thermo Scientific, USA)和Real-time PCR(ABI 7300)的連接效率檢測(cè)，在中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀酒中心Thermofisher IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)完成高通量測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀疏曲線與OTUs數(shù)分析

由圖1可知，本研究中的樣本讀長(zhǎng)(reads)均達(dá)到6萬(wàn)條以上，測(cè)序樣本物種數(shù)目(OTUs)達(dá)到平臺(tái)期，測(cè)序數(shù)據(jù)能滿足檢測(cè)微生物多樣性的要求。

圖1 樣品OTUs數(shù)與種群相對(duì)豐度的稀疏曲線Fig.1 Sparse curve of sample OTUs and the relative population abundance

2.2 基于OTUs數(shù)的韋恩圖分析

由圖2可知，各樣本的OTUs總數(shù)表現(xiàn)為竹林邊緣區(qū)J3(1 514)>非竹林區(qū)J2(1 282)>竹林核心區(qū)J1(1 233)，且J3獨(dú)有OTUs數(shù)量(245)高于J2(162)、J1(153)，說(shuō)明不同生境的交匯地帶土壤細(xì)菌基因總數(shù)和獨(dú)有基因數(shù)最高；竹林邊緣區(qū)J3與竹林核心區(qū)J1的共有OTUs數(shù)為64，但與非竹林區(qū)J2的共有OTUs數(shù)為253，這可能與竹林單一的生態(tài)環(huán)境有關(guān)，單一植物種類或會(huì)降低土壤細(xì)菌群落的群落多樣性。

圖2 基于OTUs的韋恩圖Fig.2 Venn diagram based on OTUs

2.3 物種分布情況和進(jìn)化樹(shù)分析

2.3.1 門水平上的物種分布分析

門水平上的研究顯示，采樣區(qū)域土壤細(xì)菌OTUs豐度排行前10的微生物菌門主要來(lái)自酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatinonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)以及擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicuates)和己科河菌門(Rokubacteria)。在前6種優(yōu)勢(shì)菌門中，放線菌門在全部樣品中總占比53.08%最高，其次是酸桿菌門18.57%和變形菌門10.39%，芽單胞菌門、綠彎菌門、疣微菌門總占比依次為7.38%、6.46%、4.12%。

為分析門水平上樣本間優(yōu)勢(shì)物種的差異，選取平均豐度排名前10的物種生成了Ternaryplot三元相圖。由圖3可以看出，樣本的優(yōu)勢(shì)種群主要是酸桿菌門、變形菌門、放線菌門次之、綠彎菌門的細(xì)菌等；放線菌門距竹林核心區(qū)J1更近，在J1中豐度較高；非竹林區(qū)J2中變形菌門、酸桿菌、綠彎菌門豐度較高；與J1、J2相比，竹林邊緣區(qū)J3中綠彎菌門豐度較低，變形菌門豐度高于J1低于J2。

圖3 門水平上排行前10的優(yōu)勢(shì)物種三元相圖Fig.3 The ternary plot of the Top 10 dominant species at the phylum level

為了進(jìn)一步研究樣本間的相似性，在考慮物種豐度變化的基礎(chǔ)上，從進(jìn)化角度對(duì)樣本進(jìn)行了兩兩比較，完成了基于Weighted Unifrac距離矩陣的聚類分析(圖4)。由圖4可知：竹林核心區(qū)J1與竹林邊緣區(qū)J3樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，合為一類，二者與非竹林區(qū)J2差異較大，說(shuō)明竹林土壤微生物有相對(duì)獨(dú)立和獨(dú)特的微生物群落；排行前10的細(xì)菌菌門的OTUs總數(shù)表現(xiàn)為竹林核心區(qū)J1高于J3、J2，即土壤細(xì)菌豐度從竹林核心區(qū)向非竹林區(qū)逐漸遞減；從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)來(lái)看，竹林核心區(qū)J1以放線菌門(Actinobacteria)占比最高，酸桿菌門(Acidobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)次之；竹林邊緣區(qū)J3以變形菌門占比最高，其次是放線菌門和酸桿菌門；非竹林區(qū)J2以酸桿菌門占比最高，其次是變形菌門和其他類。

圖4 門水平上的Weighted Unifrac距離矩陣聚類分析Fig.4 Cluster analysis of Weighted Unifrac distance matrix at the phylum level

2.3.2 屬或種水平上的物種分布分析

為了更為清晰地反映土壤樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的微觀變化，以相同的方法分析了土壤微生物屬或種水平上細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)和豐度(表1)。研究結(jié)果顯示，竹林核心區(qū)J1主要以酸桿菌門酸棲熱菌屬為主，放線菌門的科維粟屬、嗜酸微生物屬、蓋萊萊屬也是其優(yōu)勢(shì)菌群。竹林邊緣區(qū)J3的優(yōu)勢(shì)菌群則包括變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬、酸桿菌門苔蘚桿菌屬、芽單胞菌門金雀花屬、疣微菌門烏代桿菌屬及綠彎菌門綠彎菌屬。對(duì)非竹林區(qū)J2而言，各類菌群豐度均較低，酸桿菌門苔蘚桿菌屬成為其優(yōu)勢(shì)菌群。隨著樣本從非竹林區(qū)逐漸接近竹林核心區(qū)，個(gè)別微生物菌群的豐度發(fā)生了顯著性變化。

表1 屬或種水平上排行前10的細(xì)菌豐度差異Table 1 The top 10 bacterial abundance differences at the genus or species level

2.3.3 屬水平上的物種進(jìn)化樹(shù)分析

選擇屬水平上的Top 100代表序列進(jìn)行物種進(jìn)化樹(shù)分析(圖5)，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分支的顏色表示其對(duì)應(yīng)的門，每種顏色代表一個(gè)門。結(jié)果顯示它們主要來(lái)自共有菌屬，即在屬水平上細(xì)菌群落多有著共同起源；其在群落多樣性和豐度上存在部分交叉，表明彼此間存在一定的進(jìn)化相關(guān)性。

圖5 屬水平上Top100物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.5 Phylogenetic relationship among Top100 species at the genus level

2.4 樣本內(nèi)復(fù)雜度分析

為反映樣本內(nèi)部細(xì)菌群落的豐富度、多樣性及組間差異，進(jìn)行α群落多樣性分析(表2)。由表2可知，三個(gè)樣本Goods Coverage指數(shù)均接近于1，表明樣本測(cè)序深度非常合理，已基本覆蓋了所有物種；非竹林區(qū)J2的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均低于J3、J1，表明竹林邊緣區(qū)J3的群落多樣性、均勻性較高、J2較低；由Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)可知，竹林邊緣區(qū)J3的物種豐富度、稀有物種數(shù)量遠(yuǎn)高于J2、J1；OTUs數(shù)提示竹林邊緣區(qū)J3種群豐富，基于進(jìn)化距離和物種豐度的PD譜系多樣性指數(shù)也顯示，J3有著更大的群落物種多樣性，群落內(nèi)物種較為復(fù)雜。

表2 樣本內(nèi)α群落多樣性分析Table 2 Analysis of α diversity within-community

2.5 樣本間比較分析

為分析不同樣本的細(xì)菌群落構(gòu)成，根據(jù)樣本OTUs豐度信息，選用 Weighted Unifrac(加權(quán)距離)、Unweighted Unifrac(非加權(quán)距離)兩個(gè)距離指標(biāo)來(lái)計(jì)算兩個(gè)樣本間的距離，并描述其組間差異(圖6)，方格中的數(shù)字是兩樣本間的相異系數(shù)，同一方格上下兩個(gè)值分別代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離。

由圖6可知，非竹林區(qū)J2與竹林核心區(qū)J1的變異系數(shù)最大(0.36)，其次是與竹林邊緣區(qū)J3的變異系數(shù)(0.265)，J1與J3之間變異系數(shù)最小，說(shuō)明非竹林區(qū)與竹林邊緣區(qū)、竹林核心區(qū)在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面存在的差異較大，竹林生態(tài)系統(tǒng)具有獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖6 β多樣性指數(shù)熱圖Fig.6 Heat map of β diversity index

3 討論

3.1 酸桿菌的分布及影響因子

酸桿菌門在土壤中的數(shù)量占細(xì)菌總量的20%左右[13]，在16SrRNA 基因庫(kù)中比例高達(dá)30%～50%，僅次于變形菌門[14]，有的甚至高達(dá) 65%[15]。本文研究也發(fā)現(xiàn)，釀酒環(huán)境的竹林核心區(qū)J1中放線菌門數(shù)量最多，但酸桿菌門的酸棲熱菌屬才是其優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度達(dá)到39.26%。相關(guān)研究顯示，杉木林、馬尾松林等森林土壤細(xì)菌中酸桿菌門也是優(yōu)勢(shì)菌群(32.68%～49.17%)[16]，且中、老林的平均豐度明顯高于幼林[17]。酸桿菌的多樣性及其分布與土壤類型也有一定關(guān)系，不同的酸桿菌屬在不同林地類型土壤中相對(duì)豐度也不同。對(duì)7種常見(jiàn)樹(shù)林根際土壤的研究發(fā)現(xiàn)，其細(xì)菌多樣性較高，常綠樹(shù)根際土和落葉樹(shù)根際土酸桿菌亞群分布存在差異[18]。當(dāng)土地利用類型改變，如原始森林轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)田后，酸桿菌相對(duì)含量由28%降到16%[19]。對(duì)農(nóng)田的研究顯示，酸桿菌門平均相對(duì)豐度為24.11%，是僅次于變形菌門(29.93%)的土壤第二大細(xì)菌類群[20]?？傮w上，酸桿菌門細(xì)菌對(duì)不同環(huán)境有很強(qiáng)適應(yīng)能力，在自然環(huán)境中廣泛分布，其影響因子主要包括pH[21-22]、土壤有機(jī)碳含量、土壤 C/N[27]、地表植被類型、海拔高度[23]、大氣二氧化碳含量和土壤含氮量等[24]，在不同生境之間以及同一生態(tài)環(huán)境不同區(qū)域之間其群落結(jié)構(gòu)都存在顯著性差異[12，25]，可能在各生態(tài)系統(tǒng)中均具有獨(dú)特的驅(qū)動(dòng)作用及生態(tài)功能[25]。

3.2 特殊竹林土壤與其他竹林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

從門水平上看，竹林土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門具有高度一致性[6]，優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)成比例差異不明顯。本文研究中竹林核心區(qū)J1竹林種類為毛竹，因此其與自然生長(zhǎng)毛竹林[1，11，26]和其他竹林[7]的土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門豐度相比(表3)，放線菌門占比較高，而其他竹林土壤變形菌門占比較高。

表3 特殊竹林土壤與自然生長(zhǎng)竹林土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門豐度比較Table 3 Comparison of abundance of dominant bacteria in special bamboo forest soil and natural bamboo forest soil

從屬水平上看，本研究中竹林核心區(qū)J1主要以酸桿菌門酸棲熱菌屬為主，放線菌門的科維粟屬、嗜酸微生物屬、蓋萊萊屬也是其優(yōu)勢(shì)菌群；竹林邊緣區(qū)J3的優(yōu)勢(shì)菌群則包括變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、酸桿菌門苔蘚桿菌屬(Bryobacter)、芽單胞菌門金雀花屬(Gemmatimonas)、疣微菌門烏代桿菌屬(CandidatusUdaeobacter)及綠彎菌門綠彎菌屬(Chloroflexi)；而自然生長(zhǎng)的毛竹林地土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群[12]主要包括不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、酸熱菌屬(Acidoth-ermus)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)。上述研究表明活竹酒釀酒環(huán)境對(duì)竹林土壤產(chǎn)生了一定的影響，導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變。

竹林與其他林地土壤細(xì)菌群落種類相差較小，豐度最高的前三優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門(表4)，但綠彎菌門是竹林特有優(yōu)勢(shì)菌門[6]。對(duì)油茶林土壤微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，油茶土壤酸桿菌門、變形菌門、放線菌門和綠彎菌門相對(duì)豐度之和超過(guò)80%[27]。白樺、樟子松、興安落葉松和偃松的根圍土壤中，變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度之和均高于 75.0%[28]。本文研究中處于釀酒環(huán)境的竹林核心區(qū)J1土壤4種菌門相對(duì)豐度之和達(dá)81.6%，除綠彎菌門以外的3種菌門相對(duì)豐度之和為70.8%，放線菌門相對(duì)豐度高于其他植被類型，而變形菌門相對(duì)豐度相對(duì)較低。

表4 特殊竹林土壤與其他森林土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門豐度比較Table 4 Comparison of bacterial dominant phyla abundance between special bamboo forest soil and other forest soil

4 結(jié)論

(1)綠彎菌門是竹林特有優(yōu)勢(shì)菌門，活竹酒釀造環(huán)境使得竹林土壤放線菌門而非變形菌門數(shù)量最多。竹林核心區(qū)土壤細(xì)菌數(shù)量低于非竹林區(qū)、竹林邊緣區(qū)，或與竹林單一生境有關(guān)。

(2)竹林核心區(qū)酸桿菌門的酸棲熱菌屬數(shù)量最多，其豐度達(dá)到39.26%。竹林與非竹林區(qū)之間的交界區(qū)域群落物種豐富度、稀有物種數(shù)量較高，群落內(nèi)物種較為復(fù)雜，優(yōu)勢(shì)菌主要來(lái)自變形菌門和綠彎菌門，但其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)仍與竹林土壤相似。

(3)非竹林區(qū)的各類菌群豐度均較低，以酸桿菌門苔蘚桿菌屬為主，與竹林核心區(qū)、竹林邊緣區(qū)在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面存在的差異較大，活竹酒釀造使得竹林生態(tài)系統(tǒng)具有獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)揭示竹酒釀造區(qū)土壤微生物的響應(yīng)機(jī)制具有一定意義。