張 磊 李光輝 李曉亮 楊小梅

1.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051；2.安徽九方藥物研究院有限公司，安徽 合肥 230088；3.安徽九方制藥有限公司，安徽 亳州 236800

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi 的干燥根，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉的功效，在心腦血管病[1-2]、肝臟病、糖尿病和耳鼻喉疾病等方面具有明顯的藥理活性。葛根的主要活性成分為異黃酮類化合物，如葛根素、3′-羥基葛根素、大豆苷等[3]。葛根總黃酮是從植物葛根中經(jīng)提取分離、純化得到的黃酮類成分，具有提高免疫、增強心肌收縮力、保護(hù)心肌細(xì)胞、降低血壓、抗血小板聚集的功效。用于缺血性中風(fēng)經(jīng)絡(luò)恢復(fù)期瘀血痹阻脈絡(luò)證，動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死和腔隙性腦梗死見上證候者[4-5]。為了保證藥品的安全、有效、穩(wěn)定、均一，現(xiàn)對葛根總黃酮進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究。本文采用高效液相色譜法，對10批葛根總黃酮樣品進(jìn)行了色譜分析，建立了葛根總黃酮的HPLC特征圖譜分析方法，而中藥特征圖譜是一種多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式，能夠全面、綜合地反映和控制中藥的質(zhì)量[6]，為更好地控制葛根總黃酮的質(zhì)量提供了可靠的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀，1260 VWD紫外檢測器，Agilent色譜工作站，ADVENTURER(AR1140)電子天平(萬分之一)；METTLER TOLEDO(AB135-S)電子天平(十萬分之一)。

1.2 材料 葛根素對照品(批號：752-200108，中國藥品生物制品檢定所)；葛根素芹菜糖苷(批號：P09J7F8770)、3′-甲氧基葛根素對照品(批號：P25D6F8070)購自上海源葉生物科技有限公司；大豆苷(批號：15031507)、3′-羥基葛根素對照品(批號：15052309)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。實驗中所用試劑均為分析純和色譜純。葛根總黃酮由安徽九方制藥有限公司提供，批號：180104、180106、180106、180107、180109、180110、180111、180201、180301、180302。按以上批號順序把葛根總黃酮樣品編為S1→S10。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參照相關(guān)文獻(xiàn)[7-10]，色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：以甲醇為流動相A，0.05%磷酸水溶液為流動相B進(jìn)行二元梯度洗脫(0～50 min：20%～55%A)；檢測波長為250 nm；柱溫為 25 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取3′-甲氧基葛根素、葛根素、3′-羥基葛根素、葛根素芹菜糖苷和大豆苷對照品適量，置100 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL分別含51.2 μg、80.5 μg、52.3 μg、53.1 μg、51.6 μg的混合溶液，作為各對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取葛根總黃酮粉末約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加30%乙醇適量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 以葛根總黃酮(批號：180104)為供試品，按“2.3”項下方法制備葛根總黃酮供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以2號峰(葛根素峰) 為參照峰(S)計算5個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果顯示各共有峰的相對保留時間、相對峰面積比值的RSD均小于0.4%，表明該儀器的精密度符合分析方法的要求。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取葛根總黃酮(批號：180104)樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別進(jìn)行測定，計算各共有峰相對保留時間的RSD值在0.04%～0.17%之間，相對峰面積的RSD值在0.23%～3.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 以葛根總黃酮(批號：180104)為供試品，按“2.3”項下方法制備1份葛根總黃酮供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行測定，計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD分別在0.04%～0.14%和0.06%～3.74%之間，試驗結(jié)果表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 特征圖譜的建立與分析

2.5.1 特征峰的標(biāo)定 采用相對保留時間標(biāo)定共有特征峰。根據(jù)10批葛根總黃酮樣品特征圖譜比較，發(fā)現(xiàn)其中有5個分離較好的色譜峰為10批樣品所共有，確定此5個峰為共有特征峰；通過與對照品色譜對照，確定1號峰為3′-羥基葛根素，2號峰為葛根素，3號峰為3′-甲氧基葛根素，4號峰為葛根素芹菜糖苷，5號峰為大豆苷，如圖1、圖2所示。以2號峰(葛根素)作為參照峰，并以計算其他共有特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見表1、表2。

2.5.2 相似度分析 分別將10批葛根總黃酮樣品特征圖譜HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入“國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)”，以共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評價，相似度詳見表3。5個特征峰的相對保留時間差異較小，RSD均小于0.2%，但各個色譜峰的相對峰面積的差異性較大，表明各批次間葛根總黃酮的整體化學(xué)成分具有較好的相似性，但各批次間5個共有峰所對應(yīng)的化學(xué)成分含量有較大差異，這可能與葛根藥材的生長年限、生長環(huán)境、采收期等因素有關(guān)[11-12]。

2.5.3 質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)的建立[13]供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)5個特征峰，其中1個峰應(yīng)與參照物葛根素峰保留時間相同，以葛根素參照峰為S峰，計算特征峰1～5的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，規(guī)定值為0.692(1號峰)，1.000(2號峰)，1.072(3號峰)，1.165(4號峰)，1.236(5號峰)。

注：峰1,3′-羥基葛根素；峰2(S),葛根素；峰3，3′-甲氧基葛根素；峰4，葛根素芹菜糖苷；峰5，大豆苷圖1 葛根總黃酮對照特征圖譜

圖2 10批葛根總黃酮特征圖譜

表1 10批葛根總黃酮共有峰的相對保留時間

表2 10批葛根總黃酮共有峰的相對峰面積

表3 10批葛根總黃酮相似度

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 供試品溶液制備方法過程中，考察了以乙醇、70%乙醇和30%乙醇水溶液為提取溶劑，結(jié)果顯示用30%乙醇提取所得供試品色譜峰較全面；比較了超聲和加熱回流兩種提取方式，兩種提取方法結(jié)果無差別，選擇較簡便方法；考察了10 min、20 min、30 min的提取時間，提取20 min所得的供試品峰面積已達(dá)最高。

3.2 色譜條件的選擇 本實驗比較了不同流動相，如乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液等；等濃度洗脫與梯度洗脫；不同品牌、型號的色譜柱，如Agilent Eclipse XDB-C8(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)及ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)等。采用DAD檢測器對供試品溶液在200～400 nm進(jìn)行掃描生成三維色譜圖，對不同波長下的色譜圖進(jìn)行分析比較。不同柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃)對試驗結(jié)果的影響；對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇了色譜峰峰型較好、分離度高、基線平穩(wěn)的色譜條件。即色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)- 0.05%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，柱溫為25 ℃，檢測波長設(shè)為250 nm。

3.3 參比峰的選擇 在各批次樣品圖譜中葛根素的色譜峰較高，分離度較好，且保留時間居中，故選擇其作為參照物。

綜上，本文建立的方法專屬性強、操作簡便，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、精確度和重現(xiàn)性可檢測葛總黃酮中的多種主要成分，所構(gòu)建的特征圖譜能較全面、準(zhǔn)確的評價葛根總黃酮的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，可為葛根總黃酮的整體質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。