梁林輝 趙 君 彭 東 何鈺興 姚永秀 田近民 章 斌*

1.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院，四川 雅安 625000； 2.成都高新獨(dú)特中醫(yī)藥研究中心，四川 成都 610000

雙參四白膠囊由丹參、當(dāng)歸、川芎、白芍、赤芍、白芷、白及、蒺藜、莪術(shù)、紅參10味中藥組成，膠囊內(nèi)容物棕褐色、氣香、味微辛、微苦。主要功效為養(yǎng)血潤(rùn)膚，活血通絡(luò)，益氣祛風(fēng)。其中，君藥丹參歸心、肝經(jīng)，活血祛瘀、通經(jīng)止痛、養(yǎng)血安神[1]；紅參大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，益氣攝血[2]；佐以川芎、赤芍、白芍、白芷、白及、蒺藜、莪術(shù)活血行氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)止痛、消腫生肌。用于血虛絡(luò)阻，肌膚失養(yǎng)所致的外陰白斑癥。雙參四白膠囊為院內(nèi)方劑，在治療外陰白斑方面取得了良好的臨床療效，預(yù)申報(bào)醫(yī)院制劑，其工藝已經(jīng)確定，實(shí)驗(yàn)及中式完成。本文研究該制劑薄層鑒別和含量測(cè)定兩項(xiàng)主要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目，建立了薄層色譜法對(duì)雙參四白膠囊中丹參、白芷、當(dāng)歸、川芎四種成分定性鑒別，同時(shí)建立了HPLC法測(cè)定雙參四白膠囊中丹參酮ⅡA含量的方法，以期為雙參四白膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法的確立提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津Essentia LC-16高效液相色譜儀；島津AUW120D分析天平；JM·A30002電子天平；沃特世Symmetry-C18色譜柱；KQ-00DB數(shù)控超聲波清洗器；硅膠G薄層板；ZF-1三用紫外儀。

1.2 試藥 雙參四白膠囊(批號(hào)：20210530-1、20210530-2、20210528-1)，丹參酮ⅡA對(duì)照品(中檢所，批號(hào)：110766-202022，含量98.9%，含量測(cè)定及薄層鑒別用)；丹參對(duì)照藥材(雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院自制，批號(hào)：2011007，薄層鑒別用)；白芷對(duì)照藥材(成都瑞芬思，批號(hào)：DZYC-B-006);當(dāng)歸對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：RL6S-21MD)；川芎對(duì)照藥材(上海源葉，批號(hào)：Y06M10H82338)。

1.3 試劑 色譜純甲醇(賽默飛，批號(hào)：LOT 210774)；純化水為市售怡寶純凈水；其他試劑(分析純)均為市售常規(guī)試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹參的薄層鑒別 取雙參四白膠囊內(nèi)容物2 g，加石油醚15 mL，攪拌均勻，超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，收集上清液，揮干石油醚，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。取丹參對(duì)照藥材，粉碎，過(guò)60目篩，稱取1 g，按雙參四白膠囊供試品溶液方法制備丹參對(duì)照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對(duì)照品2.5 mg，加乙酸乙酯5 mL，超聲處理5 min，制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。取缺丹參的雙參四白膠囊陰性樣2 g，參照供試品處理方法制成陰性對(duì)照溶液。照2020版藥典(通則0502)試驗(yàn)，在同一硅膠G薄層板上，供試品、陰性對(duì)照、對(duì)照藥材及丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液分別點(diǎn)樣8 μL，以二氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)約4 cm，取出，晾干，再以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)為展開(kāi)劑[3]，展開(kāi)約10 cm，取出，熱風(fēng)干燥，可見(jiàn)光下直接檢視。供試品、丹參對(duì)照藥材和丹參酮ⅡA對(duì)照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同橙紅色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾(如圖1所示)。

2.1.2 白芷的薄層鑒別 取雙參四白膠囊內(nèi)容物5 g，加2%碳酸鈉40 mL，攪拌均勻，超聲處理15 min，3000 r/min離心5 min，棄上清液，加水20 mL，搖勻，3000 r/min離心5 min，棄上層水液；加20 mL石油醚，攪拌，超聲處理15 min，3000 r/min離心5 min，收集上層石油醚溶液，揮干石油醚，加乙酸乙酯1 mL溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤骸Ｈ∪卑总频碾p參四白膠囊陰性樣5 g，參照供試品處理方法制成陰性對(duì)照溶液。另取白芷對(duì)照藥材0.5 g，按上述方法制成對(duì)照藥材溶液。照2020版藥典(通則0502)試驗(yàn)，在同一硅膠G薄層板上，供試品、缺白芷陰性對(duì)照和白芷對(duì)照藥材溶液分別點(diǎn)樣5 μL，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)約10 cm，取出，熱風(fēng)干燥，365 nm紫外光下檢視。供試品和白芷對(duì)照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯2個(gè)相同淡黃色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾(如圖2所示)。

1：丹參酮IIA對(duì)照品溶液；2～4：雙參四白膠囊20210530-1、20210530-2、20210528-1溶液；5：缺丹參陰性對(duì)照溶液；6：丹參對(duì)照藥材溶液圖1 丹參薄層鑒別色譜圖

1：白芷對(duì)照藥材溶液：2～4：雙參四白膠囊20210530-1、20210530-2、20210528-1溶液；5：缺白芷陰性對(duì)照溶液圖2 白芷薄層鑒別色譜圖

2.1.3 當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別 取雙參四白膠囊內(nèi)容物5 g，加石油醚30 mL，攪拌均勻，超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，收集上清液，揮干，加乙酸乙酯1 mL溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。取缺?dāng)歸、缺川芎、缺當(dāng)歸和川芎的陰性對(duì)照樣各5 g，同法分別制成缺當(dāng)歸、缺川芎、缺當(dāng)歸和川芎三種陰性對(duì)照溶液。另分別取川芎、當(dāng)歸對(duì)照藥材各0.5 g，按上述方法制成對(duì)照藥材溶液。照2020版藥典(通則0502)試驗(yàn)，在同一硅膠G薄層板上，吸取供試品溶液、缺當(dāng)歸陰性對(duì)照溶液、缺川芎陰性對(duì)照溶液、缺當(dāng)歸和川芎陰性對(duì)照溶液和當(dāng)歸、川芎對(duì)照藥材溶液各5 μL，以石油醚-正己烷-乙酸乙酯(8∶3∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)約10 cm，取出，熱風(fēng)干燥，254 nm紫外光下檢視。與供試品色譜及對(duì)照品相比，缺當(dāng)歸和川芎的陰性對(duì)照在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，缺少1個(gè)淡藍(lán)色熒光和一個(gè)藍(lán)紫熒光斑點(diǎn)(如圖3所示)。

1：川芎對(duì)照藥材溶液；2：當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液；3：缺川芎陰性對(duì)照溶液；4：缺當(dāng)歸陰性對(duì)照溶液；5：雙參四白膠囊20210530-1；6：缺當(dāng)歸、川芎陰性對(duì)照溶液圖3 當(dāng)歸、川芎薄層鑒別色譜圖

2.2 丹參酮ⅡA的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水=73∶27(V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。結(jié)果表明，樣品中丹參酮ⅡA峰分離較好，峰形對(duì)稱，并且陰性無(wú)干擾，該法專屬性良好(如圖4所示)。

注：A.丹參酮ⅡA對(duì)照；B.供試品；C.陰性對(duì)照品圖4 雙參四白膠囊HPLC色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定丹參酮ⅡA對(duì)照品，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每 1 mL 含200 μg的溶液即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定雙參四白膠囊內(nèi)容物約0.5 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲處理15 min，放冷，甲醇定容，濾過(guò)，收集濾液即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺丹參雙參四白膠囊陰性樣品，按照上述“2.2.3”方法制備即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇搖勻，定容，制成質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL的對(duì)照品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示；丹參酮ⅡA的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見(jiàn)表1。結(jié)果表明丹參酮IIA的線性關(guān)系良好。

表1 線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

圖5 丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.6 精密度試驗(yàn) 參照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，選取“2.2.5”項(xiàng)下濃度為16 μg/mL丹參酮ⅡA對(duì)照品，連續(xù)進(jìn)樣5次，丹參酮ⅡA的峰面積RSD為 0.16%，儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定雙參四白膠囊樣品6份(批號(hào)：20210530-1)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，根據(jù)丹參酮ⅡA峰面積值，計(jì)算丹參酮ⅡA的含量和RSD值。結(jié)果見(jiàn)表3，丹參酮ⅡA含量的RSD值為1.37%，重現(xiàn)性較好。

表2 精密度試驗(yàn) (n=5)

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定雙參四白膠囊樣(批號(hào)：20210530-1)約0.5 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h檢測(cè)，根據(jù)丹參酮ⅡA峰面積值計(jì)算RSD值。由表4可知，丹參酮ⅡA峰面積的RSD值為0.65%，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定雙參四白膠囊樣9份(批號(hào)：20210530-1)，每份約0.5 g，三份1組，共3組。第一組3份分別加入相當(dāng)于樣品含量80%丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，第二組3份分別加入相當(dāng)于樣品含量100%對(duì)照品溶液，第三組3份分別加入相當(dāng)于樣品含量120%的對(duì)照品溶液。按本文供試品制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)丹參酮ⅡA峰面積值并計(jì)算回收率。由表5可知，丹參酮IIA平均加樣回收率為100.67%，RSD值為2.77%，該方法的準(zhǔn)確度較好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取丹參藥材、三批次雙參四白膠囊(批號(hào)：20210530-1、20210530-2、20210528-1)樣品各兩份，每份約0.4 g，按本文供試品制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，三批次雙參四白膠囊中丹參酮ⅡA含量穩(wěn)定。處方中，丹參115 g，總量385 g，轉(zhuǎn)移率為65.34%。計(jì)算公式如下：

轉(zhuǎn)移率

3 討論

雙參四白膠囊由10味中藥組成，多味藥物存在相似成分。白芷、當(dāng)歸、川芎中均含有香豆素類(lèi)、揮發(fā)油等結(jié)構(gòu)相似成分[4-7]，莪術(shù)同樣含有大量的揮發(fā)油成分[8]；白芍、赤芍都含有芍藥苷[9-10]；蒺藜和紅參主要成分為皂苷類(lèi)[11-13]。因此，相似的成分可能會(huì)對(duì)薄層鑒別產(chǎn)生較大的干擾，為薄層鑒別帶來(lái)難度。

3.1 薄層色譜條件選擇

3.1.1 丹參薄層鑒別 在薄層色譜鑒別中，本試驗(yàn)中分別對(duì)提取溶劑和展開(kāi)劑進(jìn)行了優(yōu)化篩選。在丹參的薄層鑒別中，藥典中丹參鑒別采用乙醇作為提取溶劑，但復(fù)方制劑中，藥物成分復(fù)雜，可通過(guò)降低溶劑極性，減少陰性干擾。有文獻(xiàn)報(bào)道，復(fù)方制劑中丹參的薄層鑒別采用乙醚作為提取溶劑[14-15]，考慮到乙醚的特殊氣味及麻醉性，本文采用極性相近的石油醚作為提取溶劑。本文處理比較了展開(kāi)系統(tǒng)Ⅰ[三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)],展開(kāi)系統(tǒng)Ⅱ[三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)；展開(kāi)4 cm，晾干，再用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)展開(kāi)]，展開(kāi)系統(tǒng)Ⅲ[三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)] 3種不同展開(kāi)劑對(duì)色譜情況的影響，研究發(fā)現(xiàn)3種展開(kāi)系統(tǒng)均分離良好，陰性無(wú)干擾，在使用三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)及石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)雙展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)時(shí)，丹參斑點(diǎn)分度更大，斑點(diǎn)更清晰，選取展開(kāi)系統(tǒng)Ⅱ作為雙參四白膠囊中丹參薄層鑒別的展開(kāi)系統(tǒng)。

3.1.2 白芷薄層鑒別 2020版中國(guó)藥典中白芷藥材鑒別使用的展開(kāi)系統(tǒng)為石油醚(30～60 ℃)-乙醚(3∶2)，同樣在梁璐[16]的白芷飲片的薄層鑒別和指紋圖譜研究及展月等[17]的麝香壯骨膏的薄層鑒別及烏頭堿限量的檢查方法研究中，鑒別白芷均采用石油醚(30～60 ℃)-乙醚(3∶2)展開(kāi)系統(tǒng)。本試驗(yàn)首先排除使用乙醚，并嘗試比較了環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)、石油醚(30～60 ℃)-甲苯-乙酸乙酯(8∶5∶1)、正己烷-乙酸乙酯(3∶1)4種不同展開(kāi)系統(tǒng)對(duì)色譜情況的影響，發(fā)現(xiàn)4種展開(kāi)系統(tǒng)均分離良好，在展開(kāi)系統(tǒng)環(huán)己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)為展開(kāi)劑中展開(kāi)，斑點(diǎn)顏色明顯，陰性干擾小。

3.1.3 當(dāng)歸和川芎薄層鑒別 當(dāng)歸、川芎兩藥中含有相同和相似的化學(xué)成分，如阿魏酸、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯、尿嘧啶等，在進(jìn)行鑒定時(shí)，常以相同成分作為鑒定兩藥的標(biāo)準(zhǔn)[6]。本文比較了石油醚-正己烷-乙酸乙酯(8∶3∶1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯-苯(9∶1∶5)、石油醚(30～60 ℃)-甲苯-乙酸乙酯(8∶5∶1)、正己烷-乙酸乙酯(3∶1)5種不同展開(kāi)系統(tǒng)對(duì)色譜情況的影響，發(fā)現(xiàn)石油醚-正己烷-乙酸乙酯(8∶3∶1)作為展開(kāi)劑時(shí)，分離效果較好，斑點(diǎn)清晰，陰性干擾小，邊緣效應(yīng)小。

3.2 高效液相色譜條件選擇 結(jié)合化合物的相關(guān)性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)試用色譜柱：Waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Ecosil ODS Extend-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。結(jié)果：兩種色譜柱分離度均良好，理論塔板數(shù)>5000。因此，本試驗(yàn)選擇Waters Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱。參考相關(guān)文獻(xiàn)及2020版《中國(guó)藥典》，最終設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；以甲醇-水(73：27)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。樣品中丹參酮ⅡA色譜峰與雜質(zhì)峰分離完全，峰形較好。

本研究采用薄層色譜法建立了雙參四白膠囊中丹參、白芷、當(dāng)歸、川芎四味藥定性鑒別方法和HPLC法測(cè)定雙參四白膠囊中丹參酮ⅡA含量的方法，實(shí)驗(yàn)摸索選定的薄層色譜條件分離度好，專屬性強(qiáng)，陰性干擾少，操作簡(jiǎn)便快捷；高效液相色譜法精密度高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本實(shí)驗(yàn)為雙參四白膠囊的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步制劑開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了藥學(xué)基礎(chǔ)。