張國(guó)英 耿丹丹 遲曉峰

1.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，青海 西寧 810016；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥(藏藥)質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3.青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；4.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017；5.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008

上呼吸道感染為鼻腔、咽部和喉部炎癥的總稱，包括普通感冒、流行性感冒、咽炎等，其主要由多病毒(如鼻病毒、流感病毒、冠狀病毒和腺病毒等)感染引起[1]。由于上呼吸道感染中巨噬細(xì)胞的異常激活和細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)信號(hào)密切相關(guān)，而病毒感染和缺氧引起細(xì)胞損傷的機(jī)制也和活性氧堆積引起氧化性損傷有關(guān)，因此，在常規(guī)治療中常輔以抗氧化劑進(jìn)行治療[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑可能通過(guò)抑制ROS信號(hào)依賴的巨噬細(xì)胞過(guò)度活化、預(yù)防缺氧性組織損傷以及減少病毒帶來(lái)的細(xì)胞損傷。因此，發(fā)掘臨床上應(yīng)用的治療上呼吸道感染的中藏藥材中的天然抗氧化活性成分，有望對(duì)上呼吸道感染產(chǎn)生理想的輔助治療作用，為臨床治療提供新的思路。

長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究的主流模式主要是在化學(xué)成分提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定基礎(chǔ)上利用藥理模型對(duì)得到的純化合物進(jìn)行生物活性測(cè)試。這樣的研究方法闡明了一些中藥的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)，然而該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且原藥材用量較大[19]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有不少學(xué)者建立了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的生物活性篩選-色譜在線分析方法(如抗氧化劑[20]、乙酰膽堿酯酶抑制劑[21]、α-葡萄糖苷酶抑制劑[22]等)，能夠使效應(yīng)成分的分離與篩選相結(jié)合，克服以往先從中藥中分離單體或有效部位，再分析其藥效，致使成分分離與效應(yīng)篩選脫節(jié)的弊端，大大提高了天然植物活性化合物篩選和鑒定的效率。

基于此，本研究采用HPLC-DPPH-MS/MS在線抗氧化活性篩選體系，對(duì)大花龍膽中的抗氧化活性成分進(jìn)行快速篩選與鑒定，以期為揭示藏藥大花龍膽的活性物質(zhì)基礎(chǔ)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器 本研究所用主要的儀器包括Agilent 1100 HPLC-MSD液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AG135型精密電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ-100E型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；優(yōu)普UPE-Ⅱ-40 L型超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)；定比分流閥(美國(guó)IDEX Health &Science 公司)；NP7000半制備色譜色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)；Varian INOVA 600M 核磁共振譜儀(美國(guó)Varian公司)。

1.2 主要藥品與試劑 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，批號(hào)：STBD4148V)購(gòu)于德國(guó)Sigma公司；甲醇(色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merck公司；冰乙酸(分析純)購(gòu)自天津百世化工有限公司。二丁基羥基甲苯(BHT，批號(hào)：BCBN2001V)購(gòu)于德國(guó)Sigma公司；維生素C(批號(hào)：100296-201104)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

大花龍膽采自青海省玉樹(shù)藏族自治州稱多縣(N 97.57°；E 34.01°)，由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所遲曉峰副研究員鑒定為大花龍膽(GentianaszechenyiiKanitz)，大花龍膽標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)條件 本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室自建HPLC-DPPH-MS/MS抗氧化活性在線篩選體系(如圖1所示)開(kāi)展抗氧化活性成分篩選測(cè)試。具體流程為樣品提取液經(jīng)HPLC(1)的色譜柱分離，流出液通過(guò)定比分流閥被分成大小兩部分，小流速部分(0.2 mL/min)進(jìn)入二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)；大流速部分(0.8 mL/min)進(jìn)入PEEK混合池，與HPLC(2)泵入的DPPH自由基溶液混合，樣品中的抗氧化活性成分與DPPH自由基溶液反應(yīng)后進(jìn)入紫外檢測(cè)器(UV)，在517 nm下進(jìn)行在線檢測(cè)。由于抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除作用造成的其在517 nm下吸收值降低而形成的負(fù)峰，對(duì)比DAD檢測(cè)器獲得的色譜圖與UV檢測(cè)器得到的負(fù)峰色譜圖，篩選出具有抗氧化活性的化合物，通過(guò)MS/MS數(shù)據(jù)對(duì)活性化合物進(jìn)行鑒定。

圖1 HPLC-DPPH-MS/MS抗氧化活性在線篩選體系

HPLC(1)工作條件：色譜柱，Dikma Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相，0.1%冰乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫，0～60 min，10%～55% B；柱溫，30 ℃；流速，1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量,10 μL。質(zhì)譜工作條件：離子源，電噴霧 ESI，負(fù)離子電離模式；霧化氣：N2；霧化氣壓力：40 psi；干燥氣體流速：9 L/min；干燥氣體溫度：325 ℃。

HPLC(2)工作條件:反應(yīng)環(huán)，PEEK反應(yīng)池(15 m×0.25 mm，江蘇漢邦科技有限公司)；流動(dòng)相：DPPH甲醇溶液，0.40 mL/min流速等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)517 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 DPPH溶液的配制 稱取DPPH粉末適量，精密稱定(0.0001 g)，配置成濃度為25.0 μg/mL的甲醇溶液。置于4 ℃冰箱中保存，待用。

2.2.2 供試品溶液的配制 稱取干燥的大花龍膽藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理1 h，用甲醇補(bǔ)足失重，0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

2.3 抗氧化活性物質(zhì)在線篩選 按“2.1”項(xiàng)下篩選條件，對(duì)大花龍膽花提取液進(jìn)行在線抗氧化篩選，所得色譜圖如圖2所示。從圖2中可以看出，快速篩選出共5個(gè)主要的抗氧化活性成分。經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，5個(gè)化合物的分子離子峰及碎片信息見(jiàn)表1。經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)，化合物1鑒定為為異葒草素[23]，化合物2鑒定為異金雀花素[24]，其結(jié)構(gòu)式如圖3，其余3個(gè)化合物通過(guò)質(zhì)譜信息未得到鑒定。

圖2 大花龍膽花在線抗氧化篩選色譜圖

表1 化合物1～5的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

2.4 抗氧化活性物質(zhì)分離鑒定 采用半制備液相色譜對(duì)化合物3、4、5進(jìn)行分離純化。制備色譜條件參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，并線性放大。制備色譜柱型號(hào)為Megres C18(10 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0.1%冰乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0～60 min，10%～55% B；柱溫：30 ℃；流速：4.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量：0.2 mL。在此條件下分離制備得到化合物3(3.59 mg)、化合物4 (2.4 mg)、化合物5 (25.8 mg)，HPLC檢測(cè)純度均大于98%。利用美國(guó)Varian INOVA 600M 核磁共振譜儀獲得其1H-NMR和13C-NMR 數(shù)據(jù)，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

化合物3：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.57(1H,s,H-3),7.29(1H,dd,J=1.8 Hz,8.4 Hz,H-6′),7.03(1H,dd,J=1.2 Hz,7.8 Hz,H-4′),6.77(1H,t,J=7.8 Hz,H-5′),5.37(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),5.37(3H,d,J=7.8 Hz,OMe),5.27(1H,d,J=4.8 Hz，H-1),4.52(1H,d,J=4.8 Hz,1-glc-1),3.64,3.69(2H×2,m,1-glc-6),3.46(1H,q-like,J=6.7 Hz,H-5),3.15(1H×2,m,1-glc-5),3.14(1H×2,m,1-glc-3),3.05(1H×2,m,1-glc-4),2.98(1H×2,m,1-glc-2),2.35(1H,dd,J=7.8 Hz,13.8 Hz,H-9)，2.15(1H,m,H-8),2.15,1.86(1H,m,H-6),1.06(1H,d,J=6.6 Hz,H-10)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.1(C-7′),165.1(C-11),152.4(C-3),149.6(C-2′),146.1(C-3′),120.8(C-4′),119.5(C-6′),119.0(C-5′),113.1(C-1′),110.4(C-4),98.9(1-O-glc-1),95.8(C-1),94.0(glc-1),78.125(C-7),77.8(glc-5),77.3(1-glc-5),76.7(glc-3),76.4(1-glc-3),73.1(1-glc-2),72.4(glc-2),70.0(1-glc-4),69.4(glc-4),61.2(1-glc-6),60.4(glc-6),45.1(C-9),39.9(C-8),38.8(C-6),31.0(C-5),13.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)[25]報(bào)道確定化合物3為烏奴龍膽苷E。

化合物4：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.49(1H,s,H-3),7.22(1H,dd,J=1.5 Hz,8.0 Hz,H-6″),7.02(1H,dd,J=1.5 Hz,7.8 Hz,H-4″),6.74(1H,dd,J=7.8 Hz,8.0 Hz,H-5″),5.73 (1H,ddd,J=17.5,10.6,8.3 Hz,H-8)，5.51(1H,d,J=7.0 Hz,H-1),5.34 (1H,brd,J=17.5 Hz,H-10),5.24 (1H,brd,J=10.6 Hz,H-10),4.53(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),4.25-4.3 (1H,m,H-7),3.55(3H,s,OMe),3.42,3.67(1H,m,H-6′),3.14 (1H×2,m,H-3′,H-5′),3.01 (1H,m,H-4′),2.95(1H,m,H-2′),2.86 (1H,q-like,J=6.4 Hz,H-6),2.62 (1H,q-like,J=6.8 Hz,H-9),1.87,2.00 (1H,m,H-6)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.4(C-7″),166.6(C-11),152.2(C-3),149.5(C-2″),146.0(C-3″),134.5(C-8),120.7(C-4″),119.5(C-6″),119.1(C-10),118.8(C-5″),113.0(C-1″),109.4(C-4),98.7(C-1′),95.6(C-1),77.3(C-5′),76.6(C-3′),73.0(C-2′),70.0(C-4′),63.7(C-7),61.2(C-6′),51.0(OMe),43.1(C-9),29.0(C-5),28.7(C-6)。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)[26]報(bào)道確定化合物4為為大花龍膽苷B。

化合物5：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.46 (1H,s,H-3′),7.41(1H,s,H-3),7.03(1H,dd,J=1.3,7.8 Hz,H-4″),6.75(1H,t,J=7.9 Hz,H-5″),5.68(1H,ddd,J=8.4,10.8,18 Hz H-8′),5.48(1H,d,J=7.0 Hz,H-1′),5.34(1H,t,J=4.8 Hz H-7),5.24(1H,d,J=4.8 Hz,H-1),5.17,5.28(2H,brd,J=10.6,17.4 Hz,H-10′),4.52(1H×2,d,J=4.8 Hz,1-glc-1,1′-glc-1),4.26,4.35(2H,m,H-7′),3.41,3.67(2H×2,m,glc-6),3.14(1H×2,m,glc-3),3.14(1H×2,m,glc-5),3.04(1H,m,J=8.5Hz,H-5),3.01(1H×2,m,glc-4),2.94(1H×2,m,glc-2),2.56 (1H,q-like,J=7.2 Hz,H-9′),2.77(1H,q-like,J=6.6 Hz,H-5′),2.32(1H,q-like,J=7.8 Hz,H-9),2.15 (1H,m,H-8),2.15,1.82 (1H,m,H-6),1.74,2.05(2H,m,H-6′),1.06 (1H,d,J=7.2 Hz,H-10)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.1(C-7″),166.6(C-11),166.6(C-11′) 152.1(C-3′),151.0(C-3),149.7(C-2″),146.1(C-3″),134.6(C-8′),120.8(C-4″),119.5(C-6″),119.0(C-10′),118.8(C-5″),113.1(C-1″),111.1(C-4),109.6(C-4′),98.7(1-glc-1),98.7(1′-glc-1),95.6(C-1),95.6(C-1′),78.2(C-7),77.3(1′-glc-5),77.3(1-glc-5),76.6(1-glc-1),76.6 (1′-glc-1),73.1 (1-glc-2),73.1 (1′-glc-2),70.0 (1-glc-4),70.0 (1′-glc-4),62.0 (C-7′),61.2(1-glc-6),61.2(1′-glc-6),51.1(OMe),45.1(C-9),43.1(C-9″),39.9(C-8),38.8(C-6),31.1(C-5′),29.8(C-5),29.0(C-6′),13.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)[25]報(bào)道確定化合物5為烏奴龍膽苷A。

化合物3、4、5的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 化合物1～5的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖A.異葒草素；B.異金雀花素；C.烏奴龍膽苷E；D.大花龍膽苷B；E.烏奴龍膽苷A

2.5 抗氧化活性測(cè)試 采用DPPH比色法測(cè)定上述5個(gè)化合物的抗氧化活性。分別精密稱定BHT、維生素C對(duì)照品以及異葒草素、異金雀花素、烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷B和烏奴龍膽苷A的純度大于98%自制品約1 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，待用。分別取上述對(duì)照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、2 mL于具塞試管中，用甲醇稀釋至2 mL，搖勻。得到5種不同濃度的供試品溶液。精密吸取0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL與2 mL供試品溶液于一具塞試管中震蕩搖勻，置于暗處反應(yīng)30 min，5000 r/min離心10 min后，取上清液于517 nm下測(cè)其吸光度值A(chǔ)sample；測(cè)0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL與甲醇2 mL混合后的吸光度值A(chǔ)control；測(cè)甲醇2 mL與供試品溶液2 mL混合后的吸光度值A(chǔ)blank，并用BHT和維生素C作為對(duì)照。利用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算其IC50值，結(jié)果見(jiàn)表2。

DPPH自由基清除率(%)=

(1)

由表2可知，五個(gè)化合物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，其中烏奴龍膽苷A的IC50值最低，抗氧化能力最強(qiáng)，而大花龍膽苷B的抗氧化能力最弱。各化合物抗氧化能力大小排序?yàn)椋壕S生素C>烏奴龍膽苷E>異紅草素>烏奴龍膽苷A>異金雀花素>大花龍膽苷B>BHT。

表2 化合物的抗氧化能力

3 討論

3.1 在線抗氧化活性成分的篩選條件優(yōu)化 本研究所用HPLC-DPPH-MS/MS在線抗氧化活性成分篩選是在前期實(shí)驗(yàn)室建立的在線抗氧化篩選體系基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)修改[20]。不同藥材其活性成分種類、含量以及抗氧化活性大小均具有較大差異。同時(shí)不同的色譜分離體系對(duì)該篩選方法的靈敏度、基線噪音等都有一定的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)DPPH的濃度、體積流量、反應(yīng)池的規(guī)格等因素進(jìn)行了優(yōu)化。研究中通過(guò)對(duì)比 DPPH 溶液濃度(10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL)和體積流量(0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.4 mL/min、0.5 mL/min)對(duì)篩選篩選效果的影響，結(jié)果表明隨著DPPH 濃度和體積流量的增大，方法靈敏度有逐漸增加趨勢(shì)，但較高的濃度和體積流量會(huì)造成基線波動(dòng)，影響篩選效果，因此，選擇DPPH 溶液濃度25 μg/mL，體積流量為0.4 mL/min 作為最適濃度和體積流量用于后續(xù)篩選。反應(yīng)池規(guī)格會(huì)影響反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短，從而影響篩選效果。本實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)池內(nèi)徑(0.13 mm、0.18 mm、0.25 mm)和長(zhǎng)度(5 m、10 m、15 m、20 m)進(jìn)行優(yōu)化分析。研究結(jié)果表明，反應(yīng)管越長(zhǎng)、內(nèi)徑越大，產(chǎn)生DPPH 倒峰的響應(yīng)越高，但同時(shí)較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間會(huì)造成色譜分離度下降，方法分辨率降低。綜合考慮以上因素，最終確定內(nèi)徑為0.25 mm，長(zhǎng)度為10 m 的PEEK 管為該篩選試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)最適反應(yīng)池。

3.2 抗氧化活性與構(gòu)效關(guān)系分析 從大花龍膽中分離得到的5化合物包含兩個(gè)黃酮碳苷類物質(zhì)(異葒草素、異金雀花素)和3個(gè)環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)(烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷B和烏奴龍膽苷A)。研究[20,27-28]證實(shí)，黃酮類和環(huán)烯醚萜類均是優(yōu)良的天然抗氧化劑。

抗氧化活性強(qiáng)弱與化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系[29-30]。影響黃酮、環(huán)烯醚萜等多羥基類化合物的抗氧化活性強(qiáng)弱的因素主要有以下幾點(diǎn)：酚羥基的取代數(shù)目和位置、雙鍵位置、羥基的苷化以及化合物的空間結(jié)構(gòu)等[31-33]。

異葒草素和異金雀花素的抗氧化活性具有明顯的差異，而這兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)僅在3′位置存在差異，其中異葒草素為-OH，異金雀花素為-OCH3基團(tuán)，即-OH基團(tuán)甲基化后抗氧化活性降低。在槲皮苷(槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷)和異鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖苷抗氧化活性比較中也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)[34]。因此，筆者推測(cè)3′-OH與相鄰的4′-OH形成鄰二羥基結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能是決定抗氧化活性高低的一個(gè)重要因素。

烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷B和烏奴龍膽苷A的抗氧化活性也呈現(xiàn)出一定的差異。烏奴龍膽苷E為馬錢素型的環(huán)烯醚萜苷，大花龍膽苷B為裂番木鱉酸型環(huán)烯醚萜苷，烏奴龍膽A是二聚環(huán)烯醚萜苷，三者結(jié)構(gòu)具有較大差異尤其是大花龍膽苷B的空間構(gòu)象與烏奴龍膽苷E和烏奴龍膽苷A呈現(xiàn)較大差異，這些結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象的差異可能導(dǎo)致其抗氧化活性也呈現(xiàn)顯著差異[32]。