龍金蘭 吳之坤

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 花溪 550025

黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)為蘿藦科(Asclepiadaceae)杠柳屬(Periploca)植物，植物名為黑龍骨[1]，藥材名為黑骨藤[2]。該植物多生長于海拔2000 m以下的山地疏林向陽處、陰濕的雜木林下或灌木叢中[1]，一般纏繞在周邊喬木、灌木或者高大的草本植物上。目前，以黑骨藤為主要原料的藥物黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊已研發(fā)并投入市場，在治療風(fēng)寒濕痹、腰腿疼痛等疾病方面有很好的療效。隨著野生資源的大量使用，導(dǎo)致黑骨藤野生資源面臨匱乏的危機(jī)，因此開展黑骨藤野生變家種的研究工作顯得尤為緊迫。近年來有關(guān)黑骨藤的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、質(zhì)量控制及評價等方面，而在其繁育方面未做詳細(xì)的研究。黑骨藤為多年生的藤本植物，其主要繁殖方式為有性繁殖，但有關(guān)其種子生物學(xué)方面的研究未見報道。本研究針對黑骨藤的種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，考察種子萌發(fā)消毒條件、萌發(fā)基質(zhì)、溫度和光照等不同萌發(fā)因素的影響，篩選及優(yōu)化黑骨藤萌發(fā)的最佳條件，以期為黑骨藤的野生變家種及可持續(xù)開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 黑骨藤成熟種子采集于貴陽市烏當(dāng)區(qū)香紙溝(H 1017.61 m；N 26°46′26.90″；E 106°55′12.16″)，果實(shí)采集后放置于自然通風(fēng)處及時晾干，人工剝出種子，去除種毛及雜質(zhì)，選取顆粒飽滿的種子，放置于4 ℃的短期種子庫中保存，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)所用材料經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室主任吳之坤副教授鑒定為蘿藦科杠柳屬植物黑骨藤(Periplocaforrestii)的種子，其憑證標(biāo)本(憑證標(biāo)本號：HGT201129002)存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥材種植(養(yǎng)殖)及加工研究所。

1.2 儀器與試劑 儀器：RQX-400B、RQX-400G、RQX-300型人工智能培養(yǎng)箱(常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)、AUW120D型十萬分之一天平[島津儀器(蘇州)有限公司]、游標(biāo)卡尺、XTZ-E型體式顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)、Paola2053型解剖刀、BOXUN型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、培養(yǎng)皿(直徑15 cm)、鑷子、燒杯、紗布、濾紙(15 cm)、脫脂棉、河沙等實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備及耗材。試劑：75%乙醇、0.1%高錳酸鉀和5%次氯酸鈉分別以批號為20201214無水乙醇(天津市鑫鉑特化工有限公司)、20210103高錳酸鉀(重慶川江化學(xué)試劑廠)、20210523次氯酸鈉(天津市北辰方正試劑廠)與滅菌水配置而成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子消毒條件的選擇 取黑骨藤種子，用蒸餾水沖洗種子表面污物，用濾紙吸干，再用干凈的紗布包好放置備用。隨機(jī)選取洗凈且飽滿的黑骨藤種子，用不同消毒方法[3](0.1%高錳酸鉀、5%次氯酸鈉、75%乙醇)分別對黑骨藤種子進(jìn)行表面消毒后，放置在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于人工智能培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，每次重復(fù)30粒種子，觀察種子霉?fàn)€及萌發(fā)情況并記錄，從而選擇最佳的消毒處理方法。

1.3.2 萌發(fā)基質(zhì)的選擇 用5%次氯酸鈉消毒后的黑骨藤種子置于鋪有潤濕的紗布、濾紙、脫脂棉和河沙4種不同基質(zhì)的培養(yǎng)基中，放在已設(shè)置溫度、光照等的智能人工氣候箱中培養(yǎng)，每個萌發(fā)基質(zhì)平行操作3組，每組30粒，觀察各基質(zhì)種子的萌發(fā)情況并如實(shí)記錄每日種子萌發(fā)數(shù)，選擇最適宜的萌發(fā)基質(zhì)。

1.3.3 光照條件的選擇 在消毒條件、基質(zhì)、溫度等萌發(fā)條件一定的條件下，對黑骨藤的種子進(jìn)行全黑暗、光照10 h/14 h、光照12 h/12 h、光照16 h/8 h和全光照5種光照處理，將已消毒的種子放入有潤濕基質(zhì)的培養(yǎng)皿中，置于智能培養(yǎng)箱內(nèi)觀察不同光照處理對黑骨藤種子萌發(fā)的影響，每種處理3組平行操作，每組30粒，觀察各處理種子的萌發(fā)情況并如實(shí)記錄每日種子萌發(fā)數(shù)，以此對光照條件進(jìn)行選擇。

1.3.4 萌發(fā)溫度的選擇 在消毒條件、基質(zhì)、光照等一定的條件下，將已消毒的黑骨藤種子放入已潤濕基質(zhì)的培養(yǎng)皿中，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃ 4個溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察各溫度條件下種子的萌發(fā)狀況，每種溫度重復(fù)3次，每次重復(fù)30粒種子。

注：萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為胚根突破種皮1 mm以上，萌發(fā)結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)以連續(xù)3～5 d萌發(fā)數(shù)值不再增加即停止實(shí)驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù)并且計算發(fā)芽勢和萌發(fā)率等。

1.4 指標(biāo)測定 發(fā)芽勢(S，%)=n/N×100%，式中：n為發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)，N為供試種子總數(shù)；

萌發(fā)率(F，%)=Z/N×100%，式中：Z為試驗(yàn)結(jié)束后萌發(fā)種子的總粒數(shù)，N為供試種子總數(shù)；

發(fā)芽指數(shù)[4-5]=ΣGt/Dt，式中：Gt為在時間t天發(fā)芽的種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

萌發(fā)時滯[6]：從萌發(fā)試驗(yàn)開始到第 1 粒種子開始萌發(fā)所需要的天數(shù)；

萌發(fā)歷期[6]：從萌發(fā)試驗(yàn)開始到結(jié)束萌發(fā)需要的天數(shù)。(結(jié)束萌發(fā)以萌發(fā)數(shù)不再增加的第1天為計)。

1.5 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn) 數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計，用SPSS 23 軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較不同處理之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒條件對黑骨藤種子萌發(fā)特性的影響 通過采用不同消毒條件對其進(jìn)行處理，萌發(fā)結(jié)束后統(tǒng)計各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)及分析(表1)，發(fā)現(xiàn)以5%次氯酸鈉進(jìn)行種子消毒處理的發(fā)芽勢最高，高達(dá)60%以上，顯著高于采用0.1%高錳酸鉀處理(P<0.05)，極顯著高于采用75%乙醇處理(P<0.01)。并且該條件下，種子萌發(fā)率最高(97.78%)，比0.1%高錳酸鉀、75%乙醇處理的分別高出3.34%、91.11%；采用0.1%高錳酸鉀處理比75%乙醇處理的高出77.77%。75%乙醇與5%次氯酸鈉、0.1%高錳酸鉀之間的萌發(fā)率都具有極顯著的差異性(P<0.01)。

黑骨藤種子在萌發(fā)過程中，會出現(xiàn)霉?fàn)€的情況，通過統(tǒng)計其結(jié)果(表1)，可知采用0.1%高錳酸鉀處理的發(fā)霉率最低，而75%乙醇處理的發(fā)霉率最高，比0.1%高錳酸鉀、5%次氯酸鈉處理的分別高出5.56%、4.45%。

發(fā)芽指數(shù)能體現(xiàn)出種子的活力潛能[6]，通過統(tǒng)計其結(jié)果并分析，在不同消毒處理下，可知采用5%次氯酸鈉處理的發(fā)芽指數(shù)最大，比0.1%高錳酸鉀、75%乙醇處理的分別高出6.61%、24.4%。5%次氯酸鈉與75%乙醇之間的黑骨藤種子的發(fā)芽指數(shù)差異性極顯著(P<0.01)。由此可見，采用5%次氯酸鈉處理對種子的活力促進(jìn)作用最好。

通過統(tǒng)計其結(jié)果(表1)，可知采用0.1%高錳酸鉀處理的萌發(fā)時滯最短，比5%次氯酸鈉、75%乙醇處理的萌發(fā)時滯分別縮短2.34 d、7.34 d，且5%次氯酸鈉、0.1%高錳酸鉀與75%乙醇處理的黑骨藤種子之間的萌發(fā)時滯有極顯著差異(P<0.01)。采用5%次氯酸鈉處理的萌發(fā)歷期最短，比0.1%高錳酸鉀、75%乙醇處理的萌發(fā)歷期分別縮短5 d、4 d。

綜上分析，5%次氯酸鈉消毒效果更好且能明顯促進(jìn)種子萌發(fā)，故選擇5%次氯酸鈉作為黑骨藤種子萌發(fā)的最佳消毒條件。

表1 不同消毒條件對黑骨藤種子萌發(fā)特性的影響

2.2 不同萌發(fā)基質(zhì)對黑骨藤種子萌發(fā)特性的影響 由表2可知，以河沙為萌發(fā)床的發(fā)芽勢最高，為53.33%，但其發(fā)霉率最高，高達(dá)6%以上，發(fā)芽指數(shù)最低(27.73)，說明以河沙作為萌發(fā)床對萌發(fā)的促進(jìn)作用不大；其次是濾紙，為50.00%，其發(fā)芽指數(shù)最高(30.41)，對種子的萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用；紗布發(fā)芽勢最低，為42.22%。不同萌發(fā)基質(zhì)間的萌發(fā)率，以脫脂棉和濾紙為萌發(fā)床的種子萌發(fā)率最高，均達(dá)92%以上，紗布的萌發(fā)率最低(87.78%)。

從萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期的角度分析，濾紙和脫脂棉兩種萌發(fā)基質(zhì)的萌發(fā)時滯最長，均為5.33 d，紗布的萌發(fā)時滯最短，為4.33 d；濾紙和脫脂棉的萌發(fā)歷期最短，均在17 d左右，而紗布的萌發(fā)歷期最長，達(dá)20 d以上。經(jīng)多重比較分析，4種萌發(fā)基質(zhì)之間的萌發(fā)率、發(fā)霉率、發(fā)芽指數(shù)、萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期均不具有顯著差異(P>0.05)，而河沙與脫脂棉、紗布之間的發(fā)芽勢和發(fā)霉率之間具有顯著差異(P<0.05)。

綜合分析：脫脂棉和濾紙在萌發(fā)率、萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期上無顯著差異，從發(fā)霉率和萌發(fā)效果上比較，脫脂棉較濾紙發(fā)霉率低，且種子萌發(fā)效果好，苗的根系發(fā)達(dá)，莖粗壯，故而選擇脫脂棉作為黑骨藤種子的萌發(fā)床。

表2 不同萌發(fā)基質(zhì)對黑骨藤萌發(fā)特性的影響

2.3 不同光照條件對黑骨藤種子萌發(fā)特性的影響

2.3.1 不同光照條件對黑骨藤種子發(fā)芽勢、萌發(fā)率及發(fā)霉率的影響 由圖1 A可知，在不同光照條件處理下，隨著光照時間的增加，黑骨藤種子的發(fā)芽勢、萌發(fā)率和發(fā)霉率均呈先下降后升高又下降的變化趨勢。全黑暗的發(fā)芽勢和萌發(fā)率均最高，分別為73.33%、96.67%。其發(fā)芽勢與光照10 h、光照12 h、光照16 h、全光照4種光照條件處理的發(fā)芽勢相比分別上升了58.89%、27.77%、13.33%、24.44%；萌發(fā)率與光照10 h、光照12 h、光照16 h、全光照相比分別上升了2.23%、7.78%、1.11%、5.56%；且除全光照與光照12 h之間的發(fā)芽勢無顯著性差異外(P>0.05)，其余兩兩比較均具有極顯著差異(P<0.01)，不同光照處理間萌發(fā)率差異均未達(dá)顯著水平。光照10 h處理的發(fā)霉率為零，與全黑暗、光照12 h、光照16 h、全光照相比分別降低了1.11%、11.1%、6.67%、3.33%，且各處理間發(fā)霉率均無顯著差異(P>0.05)。由此可見，光照會對黑骨藤種子前期的萌發(fā)有抑制作用，也可能誘發(fā)種子的霉?fàn)€；但適宜光照時間能促進(jìn)黑骨藤種子的萌發(fā)，對種子的萌發(fā)芽的長勢有促進(jìn)作用。

通過觀察發(fā)現(xiàn)，全黑暗處理的幼苗須根較多，主根較弱，幼苗植株根莖細(xì)且長，光照條件下幼苗矮壯，根莖較粗。對不同程度的光照時間進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)光照時間為 16 h 時，種子的萌發(fā)較快且幼苗粗壯。

2.3.2 不同光照條件對黑骨藤種子發(fā)芽指數(shù)的影響 由圖1 B可知，在不同光照條件處理下，全黑暗的發(fā)芽指數(shù)最高(38.73)；其次是光照12 h(27.55)、全光照(27.92)、光照16 h(27.17)，光照10 h的發(fā)芽指數(shù)最低，為22.35。通過兩兩比較結(jié)果分析，全黑暗與光照10 h、光照12 h、光照16 h和全光照的發(fā)芽指數(shù)之間具有極顯著差異外(P<0.01)，其余4種光照條件處理的黑骨藤種子發(fā)芽指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。由此可見，光照對種子對黑骨藤的種子活力有一定的抑制作用。

2.3.3 不同光照條件對黑骨藤種子萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期的影響 由圖1 C可知，在不同光照條件處理下，全黑暗處理的黑骨藤種子萌發(fā)時滯最短(2 d)，與光照10 h、光照12 h、光照16 h和全光照處理的黑骨種子萌發(fā)時滯差異顯著(P<0.01)；其次是光照10 h處理的，萌發(fā)時滯為4.33 d，與全黑暗相比延長了2.33 d，而與全光照、光照12 h和光照16 h處理，黑骨藤種子萌發(fā)時滯分別縮短 1 d、0.67 d、2 d，且5種光照條件處理的萌發(fā)時滯之間均無顯著性差異(P>0.05)。

全黑暗處理的黑骨藤種子萌發(fā)歷期最短(18.33 d)，與光照10 h和光照16 h、光照12 h、全光照相比分別縮短了5 d、4 d、3.67 d；光照 10 h、光照16 h處理的黑骨藤種子萌發(fā)歷期最長，均為23.33 d，且5種光照條件處理的萌發(fā)歷期之間均不具有顯著性差異(P>0.05)。

綜合結(jié)論：雖然全黑暗處理下黑骨藤種子的發(fā)芽勢、萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)很高，萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期短，苗長勢高，但苗的根及莖干均不夠發(fā)達(dá)、不夠粗壯，苗較脆弱；通過綜合分析，在有光照的條件下，選擇發(fā)芽勢、萌發(fā)率高，發(fā)霉率低且幼苗粗壯健康，光照16 h處理作為黑骨藤種子萌發(fā)的最適宜光照條件。

圖1 不同光照處理對黑骨藤種子萌發(fā)特性的影響圖

2.4 不同溫度處理對黑骨藤種子萌發(fā)特性的影響

2.4.1 不同溫度處理對黑骨藤種子發(fā)芽勢、萌發(fā)率及發(fā)霉率的影響 由圖2 A可知，在不同溫度條件處理下，隨著溫度的升高，黑骨藤種子的發(fā)芽勢呈逐漸升高的變化趨勢，在30 ℃條件下的黑骨藤種子發(fā)芽勢最高，高達(dá)54.44%，除30 ℃與25 ℃處理的黑骨藤種子發(fā)芽勢之間有顯著差異外(P<0.05)，各處理間的發(fā)芽勢兩兩比較均具有極顯著差異性(P<0.01)。

在不同溫度條件處理下，隨著萌發(fā)溫度的升高，黑骨藤種子的萌發(fā)率呈逐漸上升后下降的變化趨勢。在25 ℃溫度條件下，黑骨藤種子的萌發(fā)率最高，高達(dá)95%以上，與15 ℃、20 ℃、30 ℃相比分別上升了85.56%、3.34%、5.56%，且除與 20 ℃、30 ℃處理差異不顯著性外(P>0.05)，15 ℃與20 ℃、25 ℃、30 ℃處理的差異均達(dá)極顯著差異(P<0.01)。

在不同溫度條件處理下，隨著溫度的升高，黑骨藤種子的發(fā)霉率呈先升高后降為零又升高的變化趨勢。15 ℃和25 ℃的發(fā)霉率均為0，而30 ℃的發(fā)霉率最高(10%)。除30 ℃處理外，15 ℃、20 ℃和25 ℃發(fā)霉率之間均不具有顯著性差異(P>0.05)。

2.4.2 不同溫度處理對黑骨藤種子發(fā)芽指數(shù)的影響 由圖2 B可知，在不同溫度條件下，黑骨藤種子的發(fā)芽指數(shù)與溫度呈正相關(guān)，在15 ℃處理下，黑骨藤種子的發(fā)芽指數(shù)達(dá)最低(2.06)，與20 ℃、25 ℃、30 ℃處理之間差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。由此可知，溫度升高對骨藤種子的活力有促進(jìn)作用。

2.4.3 不同溫度處理對黑骨藤種子萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期的影響 由圖2 C可知，在不同溫度條件處理下，黑骨藤種子的萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期均呈逐漸縮短，25 ℃與30 ℃萌發(fā)時滯相同(5.33 d)，25 ℃條件下，黑骨藤種子在第5天便開始萌發(fā)，在第19天萌發(fā)數(shù)便開始不在增加。各溫度條件處理之間的萌發(fā)時滯和萌發(fā)歷期均不具有顯著性差異(P>0.05)。

通過分析發(fā)現(xiàn)，黑骨藤種子萌發(fā)的最適溫度區(qū)間在20～30 ℃之間。但25 ℃溫度下對種子萌發(fā)的促進(jìn)能力較好，且種子霉變率低，故選擇25 ℃作為黑骨藤種子萌發(fā)的最適溫度。

圖2 不同溫度處理對黑骨藤種子萌發(fā)特性的影響圖

3 結(jié)論與討論

種子在萌發(fā)過程中，長時間的水分浸潤下，會出現(xiàn)發(fā)霉腐爛的情況，選擇一種合適的種子消毒方法就顯得尤為重要。本研究結(jié)果表明，黑骨藤種子最佳的消毒條件為采用5%次氯酸鈉浸泡消毒8 min，其能起到良好的消毒效果且能促進(jìn)種子的萌發(fā)。

不同萌發(fā)基質(zhì)對種子的萌發(fā)有一定影響[7]，本研究結(jié)果表明，采用不同的萌發(fā)基質(zhì)，對黑骨藤種子的萌發(fā)有顯著影響，保水性強(qiáng)的萌發(fā)床更適于黑骨藤種子的萌發(fā)，其中以濾紙和脫脂棉的萌發(fā)率最高。研究顯示，濾紙和紗布都可作為黑骨藤種子萌發(fā)的基質(zhì)，但通過發(fā)霉率及萌發(fā)效果比較，采用脫脂棉作為萌發(fā)床，發(fā)霉率低，水分保持狀況良好且萌發(fā)效果好，幼苗莖干粗壯，根系發(fā)達(dá)，故最終選擇脫脂棉作為最佳的萌發(fā)基質(zhì)。

溫度是種子萌發(fā)所需的一個極為重要生態(tài)條件，它在種子萌發(fā)過程中起著重要的作用，是影響種子萌發(fā)的主導(dǎo)因子[8]。本研究對溫度條件進(jìn)行考察，結(jié)果表明溫度對黑骨藤種子的萌發(fā)有極為顯著的影響，為黑骨藤種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)通過對萌發(fā)溫度的篩選，認(rèn)為最適黑骨藤種子萌發(fā)的溫度為25 ℃。在25 ℃條件下，種子的發(fā)霉率低，萌發(fā)率高，且種苗長勢粗壯。

光照也是影響種子萌發(fā)的一個重要生態(tài)因子。本研究結(jié)果表明，在適宜的萌發(fā)基質(zhì)和溫度條件下，從萌發(fā)率的角度看，黑骨藤種子在萌發(fā)過程中，不采用光照萌發(fā)率最高，其對光的需求不強(qiáng)，但從綜合萌發(fā)效果等生長指標(biāo)分析，不同光照時間對黑骨藤種子的萌發(fā)均有一定程度的影響，其最適的光照時間為光照16 h/黑暗8 h。選擇合適的光照時長，對種子的萌發(fā)起著重要的促進(jìn)作用。

本研究首次對消毒條件、萌發(fā)基質(zhì)、萌發(fā)所需光照及溫度等條件對黑骨藤種子萌發(fā)進(jìn)行了單因素考察，最終通過試驗(yàn)得出了黑骨藤種子萌發(fā)的最適萌發(fā)條件，即采用5%次氯酸鈉浸泡消毒8 min，萌發(fā)基質(zhì)為脫脂棉，光照條件為光照16 h/黑暗8 h，萌發(fā)溫度為25 ℃。由此為后期的黑骨藤種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)提供了參考。