藍(lán) 遠(yuǎn)1 梁 芳* 陽(yáng)春苗 盤 涌 梁玉瓊

1.葫蘆娃藥業(yè)集團(tuán)廣西維威制藥有限公司，廣西 南寧，530031；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧，530222

舒肝顆粒(廣西標(biāo)準(zhǔn))由夏枯草、虎杖、茵陳等九味藥材配伍而成，功效為疏肝開郁、清熱解毒、化濕健脾，臨床上主要用于治療黃疸型及非黃疸型急性肝炎，深受患者好評(píng)，在廣西有廣闊的市場(chǎng)前景。方中夏枯草、虎杖、茵陳、柴胡、蒲公英均有保肝作用[1-5]，在保護(hù)肝細(xì)胞、改善肝功能、減輕肝損傷、降低脂肪肝、抗肝纖維化方面具有良好的療效[6-10]。君藥夏枯草所含活性成分迷迭香酸能夠抑制肝星狀細(xì)胞的激活和增殖分化，緩解肝纖維化；臣藥虎杖所含活性成分虎杖苷通過降低TNF-α、肝脂質(zhì)的過氧化和SREBP-1c介導(dǎo)的脂質(zhì)生成來保護(hù)肝脂肪變性；虎杖所含另一活性成分大黃素等蒽醌類化合物可抑制乙型肝炎抗原陽(yáng)性，多被用于治療急性黃疸型肝炎和慢性肝炎；臣藥茵陳所含活性成分綠原酸可以有效抑制四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷及肝纖維化、降低甲氨蝶呤誘導(dǎo)的肝毒性[11-14]，故本研究以迷迭香酸、虎杖苷、大黃素和綠原酸為檢測(cè)指標(biāo)。由于4個(gè)活性成分分屬不同類化合物，它們的最大吸收波長(zhǎng)不一樣，采用單一波長(zhǎng)檢測(cè)就會(huì)造成有的成分吸收峰比較小甚至出現(xiàn)倒峰，故本實(shí)驗(yàn)采用HPLC波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法進(jìn)行含量測(cè)定，利用不同時(shí)間段的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)可以保證4個(gè)活性成分能夠同時(shí)出峰且響應(yīng)值最大，分離效果佳，為提高原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 XS105DU十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Agilent1200(DAD/ELSD)高效液相色譜儀及色譜工作站(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；YH系列電熱套(江蘇近湖教學(xué)儀器廠)；RV-5A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(凱斯特生物化學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(上海比朗儀器有限公司)。

1.2 對(duì)照品與試劑 綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201817，供含量測(cè)定用，含量以96.8%計(jì))、虎杖苷對(duì)照品(批號(hào)：111575-201603，同上，含量以87.3%計(jì))、迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào)：111871-201706，同上，含量以90.5%計(jì))、大黃素對(duì)照品(批號(hào)：110756-201512，同上，含量以98.7%計(jì))，所有對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈購(gòu)買于Fisher公司，液相用水使用娃哈哈純凈水。

1.3 藥材 夏枯草(批號(hào)：18102001)、茵陳(批號(hào)：18022701)、蒲公英(批號(hào)：18082202)、甘草(批號(hào)：18102801)、蒼術(shù)(批號(hào)：18092504)、北柴胡(批號(hào)：18102202)、虎杖(批號(hào)：18051501)來源于廣西寶正藥業(yè)有限公司。馬蘭草、白茅根購(gòu)自廣西玉林藥市，經(jīng)我院中藥鑒定教研室苑敏副教授鑒定為馬蘭草系菊科植物馬蘭頭Kalimerisindica(L.)的干燥全草，白茅根系禾本科植物白茅ImperatacylindricalBeauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根莖。

2 舒肝顆粒的制備

按處方量稱取夏枯草100 g和虎杖75 g，加12倍量60%乙醇回流提取2次，每次80 min，濾過，合并醇提液，回收乙醇，濃縮至比重為1.26(80 ℃ 熱測(cè))的清膏，備用。稱取茵陳、蒲公英、馬藍(lán)草、柴胡各75 g和蒼術(shù)、白茅根、甘草各 50 g，加入18倍量水,浸泡40 min后，煎煮2次，每次1.3 h，濾過，合并水提液，濃縮至比重為1.26(80 ℃熱測(cè))的清膏，與上述醇提清膏合并，混勻。以清膏1份，加糖粉3份和糊精1.5份混勻，制成顆粒，干燥，即得。按上述方法制備三批舒肝顆粒，批號(hào)分別為：20200701、20200702、20200703。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 固定相為CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，設(shè)定梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，10%A；20～32 min，10%→20%A；32～40 min，20%→35%A；40～45 min，35%→70%A；45～55 min，70%→80%A；55～60 min，80%→90%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為0～20 min，327 nm，20～60 min，306 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃。分別取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，供試品溶液HPLC圖中綠原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黃素4個(gè)成分的保留時(shí)間與混合對(duì)照品溶液HPLC圖保留時(shí)間一致，分離度分別為18.74、15.77、3.36、22.70，理論塔板數(shù)分別為11246、398312、859974、1461240，結(jié)果如圖1、圖2所示。

3.2 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱定綠原酸對(duì)照品3.2 mg、虎杖苷對(duì)照品5.3 mg、迷迭香酸對(duì)照品3.4 mg、大黃素對(duì)照品2.1 mg，置25 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使溶解，再加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，備用?；旌蠈?duì)照品儲(chǔ)備液濃度為綠原酸123.9 μg/mL、虎杖苷 185.1 μg/mL、迷迭香酸123.1 μg/mL、大黃素80.64 μg /mL。

1.綠原酸；2.虎杖苷；3.迷迭香酸；4.大黃素

圖2 供試品溶液HPLC圖

3.3 供試品溶液的制備 取舒肝顆粒(批號(hào)：20200701)適量，研細(xì)，混勻，約取4 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，再用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成6個(gè)梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品濃度μg·mL-1為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液，濃度為綠原酸24.78 μg /mL、虎杖苷37.02 μg /mL、迷迭香酸24.62 μg /mL、大黃素16.13 μg /mL。連續(xù)進(jìn)樣6次，綠原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的峰面積平均值分別為453.2、1220.0、285.7、177.4，RSD值分別為0.33%、0.14%、0.04%、0.08%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份舒肝顆粒(批號(hào)：20200701)供試品溶液，室溫下放置，分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定，4種成分峰面積平均值為583.7、1090.0、310.2、170.8，RSD值為0.08%、0.07%、0.21%、0.11%。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次舒肝顆粒(批號(hào)：20200701)6份，每份4 g，精密稱定，依法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，得4種成分的含量平均值為0.3783 mg/g、0.4127 mg/g、0.3370 mg/g、0.1955 mg/g，RSD值為0.51%、0.25%、1.09%、1.20%。

3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的舒肝顆粒(批號(hào)：20200701)6份，每份2 g，置 50 mL 量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液 0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，按“3.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果均符合要求。詳見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2(續(xù))

3.9 樣品測(cè)定 取舒肝顆粒三批(批號(hào)：20200701、20200702、20200703)各4 g，精密稱定，依法操作，進(jìn)樣分析。結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g，n=3)

4 討論

4.1 指標(biāo)成分的選擇 舒肝顆粒(廣西標(biāo)準(zhǔn))由九味藥材配伍而成，夏枯草為君藥，清肝瀉火、散結(jié)消腫，配以茵陳、虎杖為臣，輔以清肝膽濕熱，退黃疸之效。柴胡疏肝解郁退熱，馬藍(lán)草、蒲公英清熱解毒抗炎、消腫散結(jié)，蒼術(shù)健脾燥濕，白茅根涼血清熱利尿，使得濕熱從小便去，作為使藥的甘草養(yǎng)陰生津、益氣和胃，與諸藥合用，共奏疏肝開郁、清熱解毒、健脾化濕之功效。本研究參考《中國(guó)藥典》2015年版一部藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[15]，選取處方中的君藥夏枯草活性成分迷迭香酸，臣藥茵陳活性成分綠原酸及虎杖活性成分虎杖苷、大黃素，采用HPLC法建立該藥品的定量方法，以期更加全面地評(píng)價(jià)舒肝顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。

4.2 供試品溶液提取方法考察 根據(jù)待測(cè)成分的理化性質(zhì)及溶解度，分別考察超聲提取法和回流提取法兩種提取方式，HPLC色譜圖顯示回流提取法產(chǎn)生的雜質(zhì)峰較多，會(huì)干擾到待測(cè)成分的分離，故選擇產(chǎn)生雜質(zhì)峰較少的超聲提取法。再分別考察提取時(shí)間20 min、30 min、40 min、60 min下的提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲提取30 min時(shí)提取率較高且時(shí)間較短，故供試品溶液的提取方法選擇超聲提取30 min。

4.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 切換波長(zhǎng)法是高效液相色譜法中同時(shí)檢測(cè)多組分含量測(cè)定時(shí)常用的一種方法。本研究測(cè)定綠原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黃素4個(gè)組分的最大吸收波長(zhǎng)分別為327 nm、306 nm、330 nm、254 nm，采用單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)不能使待測(cè)組分的響應(yīng)值達(dá)到最大，甚至在檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm時(shí)虎杖苷峰和迷迭香酸峰呈現(xiàn)倒峰，在檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm時(shí)大黃素峰呈現(xiàn)倒峰，因此必須采用切換波長(zhǎng)法才能保證4個(gè)組分能同時(shí)出峰。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)多次摸索，最終確定在0～20 min檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，20～60 min檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，可以使4個(gè)組分在高靈敏度下被檢出，同時(shí)還可以使不需要檢出的成分或干擾成分出峰較小，甚至不出峰，從而有效提高檢測(cè)結(jié)果。

4.4 流動(dòng)相的選擇 舒肝顆粒所含藥材成分多且化學(xué)性質(zhì)多樣，采用HPLC恒流測(cè)定無法將待測(cè)成分有效分離，故選擇梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定4個(gè)成分的含量。本研究先后考察不同的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)待測(cè)成分的分離效果，比較色譜峰峰形、分離度、分析時(shí)間長(zhǎng)短、基線漂移及雜質(zhì)峰干擾等情況后，最終確定用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫60 min作為HPLC梯度洗脫法，得到的色譜圖符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。

5 小結(jié)

舒肝顆粒(廣西標(biāo)準(zhǔn))原名為舒肝沖劑，收載于廣西藥品標(biāo)準(zhǔn)(一九八四年版)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為桂Q/WS-1-380-84。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)因受到歷史條件局限無法進(jìn)行含量測(cè)定檢測(cè)項(xiàng)目，不利于控制其內(nèi)在質(zhì)量，本研究是在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了該藥品的定量方法，保障了臨床用藥安全，可用于舒肝顆粒(廣西標(biāo)準(zhǔn))的質(zhì)量控制，預(yù)期舒肝顆粒(廣西標(biāo)準(zhǔn))能夠進(jìn)一步被《中國(guó)藥典》收載。提升原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為開發(fā)利用具有廣西特色民族中藥制劑提供新思路。