1.湖南醫(yī)藥學(xué)院侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418000；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000；3.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南 懷化 418000

馬卡列丙又稱毛秀才，為菊科植物顯脈旋覆花屬顯脈旋覆花Duhaldeanervosa(Wallich ex Candolle)A.Anderberg的全草，具有通經(jīng)活絡(luò)止痛、祛風(fēng)除濕、活血化瘀、消腫散血等作用，主要用于跌打損傷、骨折的治療，可顯著縮短骨折愈合的病程，是侗族從古至今常用的跌打損傷特效良藥[1-4]。迄今為止，從馬卡列丙藥材提取分離的化合物已報(bào)道有60多個(gè)，主要有揮發(fā)油類、甾體、萜類、黃酮等成分[5-8]。但是馬卡列丙促進(jìn)骨折愈合相關(guān)的藥理活性研究未見(jiàn)報(bào)道，主要有抗炎、抗氧化等作用[9-11]。小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1是研究骨形成的重要細(xì)胞模型，骨折愈合和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)藥物研究多采用該細(xì)胞進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)[12-13]。實(shí)驗(yàn)將馬卡列丙的根莖粉碎后用不同的溶劑和方法得到8種提取物，利用小鼠成骨細(xì)胞對(duì)該提取物進(jìn)行活性篩選，確定有活性的部位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于侗藥馬卡列丙的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)，為其治療跌打損傷和促進(jìn)骨折愈合的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供藥理實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材及其制備 馬卡列丙藥材購(gòu)自于云南，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院汪冶教授鑒定為菊科顯脈旋覆花Duhaldeanervosa(Wallich ex Candolle)A.Anderberg的根和根莖，其提取物制備方法如下所示。

1.1.1 揮發(fā)油和剩余水提物 藥材粉碎，過(guò)3號(hào)篩，稱取200 g，加入6倍量的純化水，采用2015版《中國(guó)藥典》2204揮發(fā)油測(cè)定法，蒸餾提取6 h，蒸餾液經(jīng)油水分離器分離出油層，加10%的無(wú)水硫酸鈉脫水，濾過(guò)，即得揮發(fā)油(I)，得率為0.23%，將上述提取液過(guò)濾，續(xù)濾液備用，殘?jiān)?，繼續(xù)加6倍量的純化水，加熱回流提取2 h，過(guò)濾，合并續(xù)濾液，減壓回收至干，即得剩余水提物(Ⅱ)，得率為37.96%。

1.1.2 石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位 藥材粉碎，過(guò)3號(hào)篩，稱取200 g，加熱回流提取3次，每次均加入6倍量的95%乙醇溶液，回流提取1 h，合并續(xù)濾液，減壓回收至干，即得醇提物(Ⅲ)，得率為5.41%，取部分醇提物，加適量水溶解，分別依次用2/3倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，減壓回收石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和剩余水液，即得石油醚部位(Ⅳ)、乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)、水部位(Ⅶ)，得率分別為0.34%、0.56%、1.24%和2.89%。

1.1.3 粗多糖 藥材粉碎，過(guò)3號(hào)篩，稱取50 g，加熱回流提取3次，每次均加入10倍量的純化水，回流提取1 h，合并續(xù)濾液，減壓回收至50 mL，即得水提液濃溶液。以1 mL/min的速度，加入無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，使其最終醇濃度為80%，靜置，過(guò)濾，取沉淀，干燥即得粗多糖(Ⅷ)，得率為5.2%。

1.1.4 藥物配制 分別稱取適量提取物用二甲基亞砜進(jìn)行溶解配置成200 mg/mL的母液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 α-MEM培養(yǎng)液、胰酶、青霉素/鏈霉素(Hyclone公司)；胎牛血清(四季青公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、 β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松(Dexamethasone，DEX)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)購(gòu)自sigma公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。基礎(chǔ)培養(yǎng)液為α-MEM，添加10%的胎牛血清和1%的青霉素與鏈霉素做為生長(zhǎng)培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液在生長(zhǎng)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加10 mM β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL的維生素C。MC3T3-E1用生長(zhǎng)培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，3～4 d傳代一次，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 儀器 倒置相差顯微鏡(Motic AE2000)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific)；多功能酶標(biāo)儀(Biotek)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期的MC3T3-E1細(xì)胞用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按5×103個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好進(jìn)行藥物處理，藥物處理時(shí)間分別為24 h、48 h和72 h，處理完后每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去掉上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解形成紫色甲瓚，充分振蕩混勻后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的吸光值。

1.6 堿性磷酸酶活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)期的MC3T3-E1細(xì)胞用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按1×105個(gè)細(xì)胞每孔接種于12孔板，第2天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液進(jìn)行藥物處理，藥物處理每3天更換1次，第6天進(jìn)行堿性磷酸酶活性測(cè)定。藥物處理完后，將培養(yǎng)板放在冰上，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗2次，再每孔加80 μL的RIPA裂解液在冰上裂解30 min。用移液槍將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，12000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液按操作說(shuō)明進(jìn)行堿性磷酸酶活性測(cè)定，用酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定值計(jì)算出樣品中的堿性磷酸酶的單位酶活。

1.7 馬卡列丙提取物促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化程度評(píng)估 細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后，按5×104/孔接種于24孔板，第二天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液進(jìn)行藥物處理，每3天更換新的藥物處理1次，培養(yǎng)14天后進(jìn)行茜素紅染色。去掉培養(yǎng)液后用PBS洗2次，用95%乙醇固定15 min， PBS洗2次，0.1%茜素紅37 ℃恒溫染色30 min，PBS洗1次，吹干，相差顯微鏡進(jìn)行拍照。采用10%的氯化十六烷吡啶對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)540 nm吸光值來(lái)評(píng)估細(xì)胞的礦化水平，進(jìn)行量化評(píng)估。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤(S.E.M)表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 馬卡列丙提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 用馬卡列丙提取物分別對(duì)小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行處理，終濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL，處理的時(shí)間為24 h、48 h和72 h，其中24 h促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用最顯著(圖1)。48 h和72 h藥物促進(jìn)細(xì)胞增殖作用不明顯，因?yàn)橘N壁細(xì)胞會(huì)有接觸性抑制作用，24 h內(nèi)是細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛期，增殖作用比較顯著。與溶劑對(duì)照組DMSO相比，正丁醇部位(Ⅵ)在50～800 μg/mL藥物濃度作用下都有促進(jìn)增殖作用。醇提物(Ⅲ)和乙酸乙酯部位(V)在100～800 μg/mL作用下有促進(jìn)增殖作用。水部位(Ⅶ)在50～100 μg/mL具有促進(jìn)增殖的趨勢(shì)，隨著濃度增高對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有抑制作用。剩余水提物(Ⅱ)沒(méi)有表現(xiàn)促進(jìn)增殖的作用，但是對(duì)細(xì)胞活力在50～800 μg/mL都沒(méi)有影響。揮發(fā)油(I)在100 μg/mL對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)的趨勢(shì)，隨著濃度增高對(duì)細(xì)胞活力具有抑制作，400～800 μg/mL 有顯著性差異。石油醚(Ⅳ)從50 μg/mL開(kāi)始對(duì)細(xì)胞活力有一定抑制作用，800 μg/mL有顯著性差異。從藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，醇提物(Ⅲ)和乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)的增殖活性作用比較好(圖1 F)。

注：與溶劑對(duì)照相比，*P<0.05，***P<0.001圖1 不同濃度馬卡列丙提取物處理MC3T3-E1細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.2 馬卡列丙提取物對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 用分化培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1進(jìn)行藥物處理，分化過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞由扁平變成梭形。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞進(jìn)行分化程度的指標(biāo)，在早期骨形成中有重要作用。經(jīng)過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分化6 d的堿性磷酸酶水平比較高，故分別用不同的提取物進(jìn)行誘導(dǎo)分化篩選堿性磷酸酶活性比較高的提取物成分，主要篩選25 μg/mL 和50 μg/mL兩個(gè)藥物濃度。與溶劑對(duì)照組DMSO相比,25 μg/mL時(shí)大部分提取物沒(méi)有誘導(dǎo)堿性磷酸酶的上升，只有剩余水提物(Ⅱ)的ALP水平上升并有顯著性差異(P<0.001)。在50 μg/mL藥物誘導(dǎo)時(shí)，乙酸乙酯部位(Ⅴ)和粗多糖(Ⅷ)具有較好的堿性磷酸酶活性，剩余水提物(Ⅱ)、醇提物(Ⅲ)、石油醚部位(Ⅳ)、正丁醇部位(Ⅵ)和水部位(Ⅶ)的堿性磷酸酶活性與陽(yáng)性對(duì)照地塞米松(DEX)的作用相似，有上升的趨勢(shì)。如圖2所示。

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2 馬卡列丙提取物誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶活性

2.3 馬卡列丙提取物對(duì)成骨細(xì)胞礦化鈣鹽沉積的影響 用分化培養(yǎng)液加不同的提取物進(jìn)行誘導(dǎo)，每3天重新更換藥物進(jìn)行處理，誘導(dǎo)分化10 d左右開(kāi)始形成礦化結(jié)節(jié)，細(xì)胞成鋪路石樣的形態(tài)，并且有黑色的顆粒物在細(xì)胞表面形成。誘導(dǎo)至第14天，礦化結(jié)節(jié)比較明顯，進(jìn)行茜素紅染色呈橘紅色顆粒，橘紅色的顆粒物的多少體現(xiàn)礦化程度。在低濃度25 μg/mL進(jìn)行誘導(dǎo)礦化效果比較好，陽(yáng)性對(duì)照地塞米松(DEX)、乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)和水部位(Ⅶ) 礦化結(jié)節(jié)比較明顯(圖3A)。對(duì)礦化結(jié)果進(jìn)行量化評(píng)價(jià)，陽(yáng)性對(duì)照DEX和乙酸乙酯部位(Ⅴ)具有顯著性差異，此外醇提物(Ⅲ)、正丁醇部位(Ⅵ)、水部位(Ⅶ)和粗多糖(Ⅷ)鈣鹽沉積有增多的趨勢(shì)(圖3B)。

注：與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0.05。圖3 馬卡列丙提取物低濃度誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞礦化效果

高濃度50 μg/mL進(jìn)行誘導(dǎo)礦化的時(shí)候，在25 μg/mL有礦化效果的提取物的作用大部分下降了。剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)表現(xiàn)出較強(qiáng)的礦化效果，有明顯的礦化結(jié)節(jié)，在量化評(píng)價(jià)的時(shí)候有顯著性差異(圖4)。

注：A.礦化的形態(tài)圖；B.礦化的量化圖；*P<0.05，**P<0.01。圖4 馬卡列丙提取物高濃度誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞礦化效果

2.4 馬卡列丙提取物促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成過(guò)程的活性篩選結(jié)果 馬卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化都有促進(jìn)作用，醇提物(Ⅲ)和正丁醇部位(Ⅵ)促進(jìn)增殖比較明顯，但是分化和鈣化活性不明顯。剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)雖然不能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，但是具有明顯的分化和礦化活性。此外，水部位(Ⅶ)有分化和礦化的趨勢(shì)，石油醚部位(Ⅳ)在低濃度有微弱的鈣化趨勢(shì)(表1)。

表1 馬卡列丙提取物活性篩選比較匯總

3 討論

實(shí)驗(yàn)主要評(píng)價(jià)了馬卡列丙提取物對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化的影響。結(jié)果表明馬卡列丙提取物有些部分含有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的有效成分，其中乙酸乙酯部位(Ⅴ)效果最為明顯，在增殖、分化和礦化過(guò)程中都明顯高于陰性對(duì)照，與陽(yáng)性對(duì)照組DEX相似。此外，剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)在分化和礦化作用評(píng)價(jià)時(shí)具有比較好的活性，但增殖活性較弱。促進(jìn)增殖時(shí)有較好活性的醇提取物(Ⅲ)和正丁醇(Ⅵ)在分化和礦化的活性篩選較弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雖然有些提取物成分沒(méi)有對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化都具有活性，但是在成骨細(xì)胞骨形成過(guò)程的其中1～2個(gè)階段發(fā)揮作用。中藥在促進(jìn)骨折愈合的作用是多方面的，侗藥馬卡列丙有多個(gè)組分對(duì)跌打損傷和促進(jìn)骨折愈合產(chǎn)生作用。綜上所述，侗藥馬卡列丙對(duì)跌打損傷和促進(jìn)骨折愈合具有促進(jìn)作用的有效成分主要集中在乙酸乙酯(Ⅴ)部位，但是正丁醇(Ⅵ)、剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)等提取物中也含有一些可以促進(jìn)骨形成的化合物。要明確其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的化合物成分，還需要進(jìn)一步分離純化和藥物活性篩選。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)侗藥馬卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化具有一定的促進(jìn)作用，為該藥用于治療骨折及骨質(zhì)疏松癥提供了初步的藥效學(xué)研究基礎(chǔ)。為馬卡列丙藥材的進(jìn)一步提取分離和開(kāi)發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是提取物成分復(fù)雜，不能完全排除非特異性物質(zhì)對(duì)活性的干擾，因此進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)將利用大鼠脛骨骨折動(dòng)物模型進(jìn)行整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)骨折愈合過(guò)程中馬卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)促進(jìn)骨折愈合的體內(nèi)作用；并對(duì)乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行提取分離和鑒定，明確促進(jìn)骨形成的化學(xué)成分。