周漢琛，楊霽虹，徐玉婕，吳瓊，雷攀登

香葉醇生物合成相關基因的進化分析

周漢琛，楊霽虹，徐玉婕，吳瓊，雷攀登*

安徽省農業(yè)科學院茶葉研究所，安徽 黃山 245000

茶樹中存在2個亞細胞定位不同的基因（和），其中定位于細胞質的基因與香葉醇生物合成密切相關。為探究基因在不同茶樹品種中的序列、功能差異及其在物種間的進化，通過序列比對、基因克隆、進化樹構建、代謝物分析、功能驗證等分析了該基因在茶樹與非茶樹植物中的進化以及香葉醇積累差異。結果表明，不同茶樹基因庫中組裝的核苷酸序列存在差異；RT-PCR克隆顯示4個阿薩姆變種和4個中國變種茶樹中均有和的陽性克隆，且核苷酸序列存在差異。利用Phytozome網站數據進行序列比對及進化樹構建，結果顯示共有58個植物中存在同源基因；該基因在植物物種間較為保守，在低等植物藻類基因組中也存在；在單子葉禾本科植物中，除短柄草（）泛基因組中存在蛋白序列匹配率大于58%的目的基因，其余均較低，尤其是在部分禾本科植物中該基因存在缺失。代謝物分析表明15個禾本科植物水稻、小麥和玉米品種鮮葉中均未檢測到香葉醇的合成，而4個茶樹品種嫩梢中香葉醇含量為0.87～4.12?μg·g-1。此外，茶樹基因在幼嫩葉片中有高表達；阿薩姆變種茶樹佛香3號的同樣具有合成香葉醇的功能。本研究表明，基因廣泛存在植物基因組中，在茶樹基因組中存在2個基因，并與茶樹葉片中香葉醇的合成相關。

香葉醇；基因；進化分析；Phytozome；茶樹

萜類物質是自然界最為豐富的一類化合物，包括其衍生物已經發(fā)現(xiàn)約80?000種，其中包含植物、細菌、真菌界等[1]。許多萜類物質參與了生物體的基礎代謝，如脫落酸、赤霉素和獨角金內酯等萜類激素，以及植物萜類色素物質番茄紅素（Lycopene）、-胡蘿卜素（-carotene）等[2]。這類萜類物質一般不具有揮發(fā)性。而許多小分子萜類物質具有揮發(fā)特性，比如擬南芥在開花過程中釋放出多種類萜類物質，包含單萜類化合物芳樟醇、月桂烯、羅勒烯和檸檬烯，以及倍半萜類化合物-法尼烯、石竹烯、()-橙花叔醇、()-橙花叔醇、羅漢柏烯等[3]，這類揮發(fā)性萜類物質對植物具有重要的生物學意義，如吸引昆蟲傳粉，防御病原菌侵害等[4]。茶樹中的研究顯示，倍半萜類物質橙花叔醇，以葡萄糖苷形式儲存在細胞中，參與茶樹防御冷脅迫[5]。

香葉醇是一類單萜類化合物，具有玫瑰花香，在植物花器官中含量豐富，比如玫瑰花等。香葉醇在茶樹葉片中大量富集，對茶葉香氣形成具有重要貢獻。植物中的萜類物質來源于異戊烯焦磷酸（Isopentenyl diphospthate，IPP）及其異構化合物二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）[6]。在植物體中，一般通過質體中的甲基赤蘚醇磷酸（Methylerythritol phosphate，MEP）途徑和細胞質中的甲羥戊酸（Mevalonic acid，MVA）途徑形成單萜類香氣前體牻牛兒基焦磷酸/香葉基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP）和倍半萜類香氣前體法尼烯焦磷酸，再由萜類合成酶（Terpene synthase，TPS）催化生成相應萜類化合物[7]。目前植物中香葉醇生物合成途徑，及相關功能基因的研究已有相關報道[8-10]。甜羅勒中的香葉醇合成酶（Geraniol synthase，GES）基因，能夠直接催化香氣前體物質GPP生成香葉醇，將其過量表達于番茄中，顯示轉基因番茄中的香葉醇積累量極顯著增加[9-10]。

最近的研究表明萜類物質的生物合成還存在其他代謝途徑。Magnard等[11]發(fā)現(xiàn)，核苷二磷酸水解酶（Nucleoside diphosphate hydrolase，Nudix）基因家族中定位于細胞質的基因可以通過催化單萜前體物質GPP生成GP（Geranyl monophosphate），再由磷酸酶去掉一個磷酸基團生成香葉醇，且此途徑可能是玫瑰中香葉醇的主要生物合成途徑。與TPS直接催化香氣前體物質GPP相比較，NUDX1則需要其他磷酸酶參與，間接促進香葉醇的生物合成。近期研究結果顯示[12]，茶樹中存在2個亞細胞定位不同的同源基因，分別是和；體外酶活顯示定位于細胞質的可催化GPP生成GP，而定位于質體的催化底物GPP效率較低；將過表達在本氏煙草中，能夠顯著促進葉片中香葉基櫻草糖苷的積累，而過表達本氏煙草葉片中香葉基櫻草糖苷含量只有少量增加。為進一步解析茶樹中生物學功能，及基因在植物間的進化，本研究利用已發(fā)布的茶樹基因組數據及Phytozome網站139個植物基因組數據，深入分析植物中基因的進化模式，并檢測香葉醇在不同植物葉片中的含量，旨在為后續(xù)研究香葉醇生物合成途徑及關鍵酶基因選擇有重要指導作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試茶樹品種為皖茶4號、皖茶91、舒茶早、鳧早2號、中茶108、浙農117、佛香3號、云抗10號、雪芽100和紫娟取材于安徽省農科院茶葉研究所繁育基地，取樣后立即置于液氮中，并于–80℃冰箱保存。本研究中供試小麥（）品種鄭麥366、皖麥50、濟麥22、矮抗58、煙農19；玉米（）品種煙玉604、煙玉958、煙玉601、煙玉206、迪卡517；水稻（）品種天隆優(yōu)619、甬優(yōu)4901、徐稻63646、圣香1826、早香粳1號為安徽省農業(yè)科學院作物所提供，以上15個禾本科植物種子在溫室利用1∶1的營養(yǎng)土、蛭石培育1個月后，取新鮮葉片儲存于–80℃冰箱，用于后續(xù)揮發(fā)物分析。

1.2 RT-PCR克隆茶樹CsNUDX1s基因

利用RNA提取試劑盒[DP441，天根生化科技（北京）有限公司]提取茶樹總RNA，然后使用反轉錄試劑盒[RR036A，寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]合成cDNA。利用KOD高保真PCR酶[KOD-401，東洋紡（上海）生物科技有限公司]克隆不同茶樹品種中的（F：GGATCCATGGAAAGCAAGTCTCAGC，R：GAGCTCTCATTTATTATCAGCTGGG）和（F：TCTAGAATGGTGCCCAATCAGCAAGCTT，R：GAGCTCTCATTTTTGATCAGCTGGAAAGGGA）基因。PCR產物純化后，連接克隆載體pEASY-Blunt（CB101，北京全式金生物技術有限公司）進行測序分析。

1.3 NUDX1系統(tǒng)進化分析

利用玫瑰（NCBI登錄號：JQ820249）和擬南芥基因（AT1G68760）蛋白序列，對Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov）網站蛋白庫數據進行BLASTP分析，以獲得不同植物中的同源基因；利用Figtree（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree）對獲得的NUDX1蛋白序列進行進化樹分析；利用ClustalW2對不同物種NUDX1的Nudix結構域進行比對分析。

1.4 香葉醇含量測定

茶樹、小麥、玉米和水稻不同品種鮮葉中的揮發(fā)性化合物分析方法如下：利用液氮將新鮮樣品研磨粉碎后，準確稱取0.2?g樣品，加入2?mL含有200?μL 300?mg·mL-1AR2000（廣譜糖苷酶）的蒸餾水，于37℃水浴下反應20?min后，利用SPME萃取頭（50/30μm DVB/CAR/PDMS Stableflex，USA）于60℃水浴下吸附30?min，用于氣相色譜分析。

1.5 GC分析

本研究中利用島津2010 GC（日本島津公司）對樣品中的揮發(fā)物進行分析。檢測器為FID通道；色譜柱為RTX-MAX（30?m×0.25?mm×0.25?μm）。具體參數：總流量為13?mL·min-1；柱流量為1?mL·min-1；線速率為25.6?cm·s-1；分流比為9∶1；尾吹流量為30?mL·min-1；氫氣流量為40?mL·min-1；空氣流量為400?mL·min-1；火焰溫度為280℃。吸附完成的SPME萃取頭立即于250℃下解吸附5?min。柱溫箱升溫程序為：40℃保留2?min，以4℃·min-1上升至85℃并保留2?min；以3℃·min-1上升至110℃并保留1?min；以4℃·min-1上升至200℃并保留1?min；最后以15℃·min-1上升至250℃并保留5?min。

以香葉醇標準品（中國默克有限公司）流出時間對不同樣品中的香葉醇進行鑒定，利用標準品與樣品中香葉醇峰面積之比計算含量，結果表示為μg·g-1鮮重（Fresh weight，F(xiàn)W）。

1.6 基因表達分析

1.7 CsNUDX1-cyto功能分析

利用一步克隆試劑盒（C112，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將不同茶樹品種的基因與植物雙元表達載體PBI121連接，測序正確后轉化農桿菌GV3101（上海唯地生物技術有限公司）。配制侵染緩沖液（MES 10?mmol·L-1，MgCl220?mmol·L-1，乙酰丁香酮200?μmol·L-1），將帶有PBI121-質粒的農桿菌注射本氏煙草葉片。3?d后收取瞬時表達葉片并立即置于液氮中研磨，稱取0.2?g并加入5?mL超純水和200?μL 200?mg·mL-1AR2000，37℃水浴平衡20?min后，利用65?μmol·L-1PDMS/DVB SPME萃取頭于70℃水浴下吸附30?min，用于GC-MS分析。

1.8 數據分析

利用SPSS 19.0軟件對不同樣品中香葉醇含量及基因表達水平差異進行方差分析，其中采用Duncan運算法，以檢驗不同樣品間的顯著性（<0.05，<0.01）；基因表達與香葉醇含量間的相關性分析是利用SPSS 19.0軟件中的Pearson相關系數運算方法獲得。

2 結果和分析

2.1 NUDX1基因進化分析

研究表明舒茶早基因組（http://tpdb.shengxin.ren）中含有2個與同源的茶樹基因，分別是（）和（）（表1）。蛋白序列含有220個氨基酸，具有質體信號肽，亞細胞分析顯示定位于質體中，而定位于細胞質中[12]。茶樹品種碧云基因組中存在2個基因，與舒茶早基因組比對結果相似；古茶樹基因組中的與栽培品種舒茶早基因組中的蛋白序列存在5個氨基酸的差異。在各基因組數據中的比對結果差異較大，例如龍井43基因組中，序列組裝與舒茶早、碧云基因組中的序列存在差異；在古茶樹基因組中該基因匹配到2個基因（表1）。

表1 不同茶樹基因組中CsNUDX1-cyto和CsNUDX1-chlo序列比對

序列差異，結果顯示4個阿薩姆變種茶樹佛香3號、云抗10號、雪芽100、紫娟和4個中國變種茶樹舒茶早、皖茶91、中茶108、浙農117中均有和的陽性克?。▓D1-A），以測序結果為例，顯示該基因5'端序列在不同茶樹品種中存在差異（圖1-B）；蛋白序列分析顯示，8個品種的基因在N端存在差異，其中云抗10號與雪芽100中的蛋白序列完全相同；舒茶早在N端與其他7個品種中存在2～4個氨基酸的差異；酶催化位點Nudix結構域在8個茶樹品種中均未有序列變異（圖1-C）。

以蛋白序列為靶序列，顯示Phytozome網站中共有6個植物基因組中存在定位于質體中的基因，且均分布在雙子葉植物基因組中，如樟樹（）和向日葵（）（圖2）。

目前Phytozome網站共收錄了139個植物物種的261個基因組數據。以已驗證功能的基因蛋白序列為靶序列，對Phytozome網站蛋白庫數據進行比對分析。結果顯示，共有58個植物中目的基因蛋白序列匹配率（Identity）達到64%～100%，其中蛋白序列長度為141～192個氨基酸。值得注意的是，基因在綠藻類植物（Chlorophyte）中也廣泛存在（圖2），但是在禾本科植物（Grass）中，基因存在缺失，如、水稻（）、柳枝稷（）、粟（）、高粱（）、玉米（）等。

注：（A）RT-PCR克隆，（B）CsNUDX1-cyto測序序列比對，（C）CsNUDX1-cyto氨基酸序列比對

以Phytozome網站單子葉植物蛋白庫為目標，結果顯示，蘆筍（）菖蒲（）、大葉藻（）、參薯（）和紫萍（）基因組中存在與、匹配率大于58%的目的基因；其他單子葉植物基因組中目的基因匹配率均低于50%，為26%～50%。

注：NUDX1-chlo表示預測定位于質體中的NUDX1基因

2.2 NUDX1功能結構域變異分析

Nudix功能結構域（GX5EX7REUXEEXGU）是NUDX1催化底物GPP重要位點[19]，且其中精氨酸R后面的谷氨酸E位點對NUDX1酶活性至關重要。分析顯示，Nudix結構域在不同植物物種中的保守性均較高，重要活性位點E均未變異。以已鑒定功能的擬南芥的Nudix結構域為研究對象，顯示雙子葉植物中Nudix功能結構域變異較小，存在1～3個氨基酸位點不一致，而藻類植物中細小微胞藻（）基因的Nudix結構域與擬南芥中的差異較大，存在9個氨基酸位點的差異（圖3）。

茶樹基因Nudix結構域與擬南芥中的基因存在2個氨基酸位點的差異。以擬南芥基因Nudix結構域為目標序列，對禾本科植物基因組進行比對，顯示短柄草（）泛基因組（pan-genome，ID:335）數據中存在Nudix結構域，且與擬南芥中的基因結構域有6個氨基酸位點差異，而重要活性位點E未變異，在Genbank中對該基因進行BLASTP比對，結果顯示該基因為Nudix基因家族成員，與NUDX23蛋白序列相似度最高。

圖3 植物中NUDX1功能結構域分析

2.3 茶樹和禾本科植物中香葉醇含量的測定

為探究禾本科植物中香葉醇的合成，以水稻、玉米、小麥不同品種鮮葉為材料，同時分析了4個茶樹品種嫩梢中的香葉醇含量。由圖4可知，以香葉醇標準品保留時間為基準，顯示茶樹品種舒茶早、皖茶4號樣品相同時間內出現(xiàn)明顯的離子峰，而水稻品種甬優(yōu)4901、徐稻63646鮮葉中相同時間內未有離子峰出現(xiàn)（圖4-A）；相同處理下，小麥品種矮抗58、皖麥50鮮葉中也沒有明顯離子峰出現(xiàn)（圖4-B）；玉米品種迪卡517、煙玉206鮮葉中也均未檢測到香葉醇的合成（圖4-C）。研究結果表明4個茶樹品種的嫩梢中香葉醇含量為0.87～4.12?μg·g-1，而本研究中15個禾本科植物品種鮮葉中均未檢測到香葉醇的合成（圖4-D）。

2.4 茶樹CsNUDX1s基因在葉片中的表達模式及功能分析

對茶樹品種舒茶早嫩梢進行研究，結果顯示（圖5），2個茶樹基因在嫩葉中的表達量最高，在發(fā)育成熟度高的葉片中表達量較弱。與Cs在第一葉、莖中的表達水平差異不大，在第二葉中的表達量達到顯著水平（<0.05），而在第三葉中的表達量達到極顯著水平（<0.01，圖5-A）。香葉醇含量分析顯示，其在幼嫩葉片中積累量最高，達到3.3?μg·g-1；在發(fā)育成熟度較高的葉片中含量較低，為0.7?μg·g-1（圖5-B）。相關性分析表明，葉片中香葉醇的含量與茶樹、2個基因的表達量存在相關性，相關系數分別為0.897和0.756。

注：（A）2個水稻品種鮮葉中酶解香葉醇與茶樹嫩梢酶解香葉醇離子峰比較；（B）2個小麥品種鮮葉中香葉醇離子峰分析；（C）2個玉米品種鮮葉中香葉醇離子峰分析；（D）香葉醇含量分析。nd表示未檢出

注：（A）2個茶樹NUDX1基因表達分析；（B）茶樹嫩梢不同部位香葉醇含量分析；（C）舒茶早和佛香3號中CsNUDX1-cyto過表達產物分析。不同大小寫字母代表2個NUDX1基因在茶樹嫩梢不同部位的表達差異（P＜0.05）；*、**分別代表差異顯著性（P＜0.05，P＜0.01）；ns表明無顯著差異

基于基因克隆及測序分析，顯示阿薩姆變種茶樹佛香3號和中國變種茶樹舒茶早中的蛋白序列存在差異。為探究佛香3號茶樹品種中的催化功能，本研究將其過表達在本氏煙草葉片中并檢測香葉醇的合成（圖5-C），結果顯示，與對照相比（侵染液處理葉片），過量表達FX3-和SCZ-均能促進香葉醇的合成。

3 討論

基因在植物中廣泛存在，研究顯示基因家族成員數量在植物中屬于中等類型，在擬南芥、水稻、楊樹和葡萄中分別包含32、33、53個和30個家族成員[20-21]?；蚣易宄蓡T氨基酸序列一般比較短，由145～320氨基酸序列組成，一般在N-端含有金屬結構域，在C-端含有催化結構域，且該基因家族成員的催化底物比較多樣化，比如GPP、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）以及焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate，TPP）等。同源基因家族成員蛋白結構中含有23個保守氨基酸序列，為Nudix結構域（GX5EX7REUXEEXGU），是該酶催化底物區(qū)域[12]。

基于Phytozome網站數據，基因的進化分析表明該基因不僅在高等植物中廣泛存在，在低等植物綠藻中也存在，這表示該基因較為原始，由其催化GPP生成GP，再由磷酸酶催化生成香葉醇的生物合成途徑可能廣泛存在植物系統(tǒng)中。有趣的是，部分禾本科植物中該基因存在缺失，且通過揮發(fā)性物質分析，顯示香葉醇在這類植物中合成很少，或幾乎沒有。然而，茶樹中存在2個亞細胞定位不一致的基因，一個定位于細胞質，而另一個定位于質體，且在其他雙子葉植物中也出現(xiàn)同源的定位于質體中的基因。在植物進化過程中，存在大量的DNA復制事件，或全基因組復制事件（Whole-genome duplication，WGD）。以茶樹為例，顯示茶樹基因組曾遭遇WGD事件，使得同源基因得到大量復制[14]，比如糖基轉移酶基因家族在低等植物萊茵衣藻（）中只有1個家族成員[22-23]，而在茶樹中存在307個家族成員[14]。

茶樹中富含香葉醇，尤其是其嫩梢中[24]，對綠茶、紅茶、烏龍茶的香氣品質均有貢獻[25-27]。研究顯示，水稻正常生長狀態(tài)和逆境下，均未檢測到香葉醇的合成[28]，揮發(fā)性化合物正常生長狀態(tài)下積累較少，且多為芳樟醇、檸檬烯、水楊酸甲酯、吲哚等；在秋葉蛾侵襲后，大量的倍半萜類化合物被釋放，如，石竹烯、法尼烯、姜烯等。本研究顯示禾本科植物水稻、玉米基因組中未匹配到基因，且本研究中15個禾本科植物品種鮮葉中也均未檢測到香葉醇的合成，這可能與該基因的缺失相關。功能分析顯示，阿薩姆變種茶樹佛香3號中的同樣具有促進香葉醇合成的功能。Takeo[29]研究顯示阿薩姆變種茶樹中的香葉醇含量明顯低于中國變種茶樹，后續(xù)研究中可通過分析的調控機制，探究香葉醇合成在兩個茶樹變種中存在差異的原因。

綜上所述，香葉醇生物合成相關基因廣泛存在于低等、高等植物中；在部分禾本科植物基因組中，該基因存在缺失；茶樹基因組中存在2個基因，在茶樹幼嫩葉片中表達量較高，并與香葉醇合成相關。

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Phylogenetic Analysis ofGene Involved in Geraniol Biosynthesis

ZHOU Hanchen, YANG Jihong, XU Yujie, WU Qiong, LEI Pandeng*

Tea research institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, China

Geraniol is an acyclic monoterpene alcohol, which plays key roles in plant-environment interactions, such as pest repelling, antimicrobial activity, and pollinator attraction as well as the aroma traits for tea plants. It was reported that a cytosolic Nudix hydrolase (NUDX1) catalyzes geranyl pyrophosphate (GPP) into geranyl monophosphate (GP), followed by dephosphorylation with an endogenous phosphatase to produce geraniol. Two homologues ofwere found in tea genome (and) with different subcellular location. Searching the homologues ofon Phytozome shows that fifty-eight plant species contain the homologues of(with identities＞64%)However, no homologue ofwas found in the genomes of grass species, with the exception ofWe thus detected AR2000-enzymed geraniol in fresh leaves of rice, wheat, maize, and tea plants. The results show that free geraniol was undetectable in fresh leaves of rice, wheat and maize, where as young shoots of four tea cultivars had high levels of geraniol (0.87-4.12?μg·g-1). Twogenes were highly expressed in young tea leaves and had a positive correlation (above 0.7) with the accumulation of geraniol. This study shows thats are widely present in plant genome, which are closely related to the formation of geraniol.

geraniol,gene, phylogenetic analysis, Phytozome,

S571.1；Q52

A

1000-369X(2022)05-638-11

2021-11-02

2022-02-17

國家自然科學基金（32002096）、安徽省農業(yè)科學院青年英才計劃（QNYC-202119）

周漢琛，女，博士，研究方向為茶樹生物化學及分子生物學，Tuesday1011@163.com。*通信作者：lpteagle@126.com