李江偉，李貞，夏雨涵，黃培，李振乾，秦慧，高冬玲

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，鄭州 450052）

在臨床病理診斷中，免疫組織化學(xué)越來越成為不可或缺的診斷技術(shù)。冷凍切片由于組織新鮮、抗原丟失少等優(yōu)勢很早便用于免疫組織化學(xué)檢測。但冷凍切片也有缺點(diǎn)，組織形態(tài)差異大、存在冰晶等因素影響了其免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[1]。本實(shí)驗(yàn)選取兩個(gè)在乳腺腫瘤組織中表達(dá)普遍的胞質(zhì)蛋白晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）[2]和胞核蛋白Ki-67作為研究對(duì)象，分析其在石蠟和冷凍切片中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討冷凍切片用于免疫組織化學(xué)檢測的適用條件和價(jià)值。

材料與方法

1 材料

選取我院2021年9月到11月的乳腺腫瘤術(shù)中切除標(biāo)本15例，其中乳腺浸潤癌13例，導(dǎo)管原位癌1例，葉狀腫瘤1例。分別收集這15例標(biāo)本的冷凍切片和相對(duì)應(yīng)的石蠟切片若干。

1.1 試劑

實(shí)驗(yàn)室自配乙醇-冰醋酸-甲醛（ethanol-acetic acid-formaldehyde，EAF）固定液[3]，用于冷凍切片的固定；0.01 mol/L PBS緩沖液（pH7.4）購自萊寶生物技術(shù)公司。兔抗RAGE一抗購自Bioss公司，兔抗Ki-67一抗購自Wanleibio公司，通用型羊抗兔/鼠SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.2 主要儀器

Leica 3050S冷凍切片機(jī)，K-Viewer圖像掃描儀，Image-Pro plus 6.0 圖像分析軟件。

2 方法

2.1 標(biāo)本制備

新鮮的乳腺腫瘤組織經(jīng)取材后于冷凍切片機(jī)中（-24 ℃）6 μm切片，隨后立即用EAF固定液固定8 min[4]；每例對(duì)應(yīng)的冰余組織待固定、脫水和石蠟包埋后4 μm切片。以上切片均立即行免疫組織化學(xué)檢測或-20 ℃冰箱內(nèi)保存，但保存時(shí)長均不超過2周[5]。

2.2 SP法免疫組織化學(xué)染色

SP法免疫組織化學(xué)染色：①脫蠟和水化；②0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）抗原熱修復(fù)；③胞膜通透劑0.3% Triton X 100孵育10 min；④3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；⑤正常山羊血清封閉；⑥一抗37 ℃恒溫孵育1 h；⑦生物素標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG 37 ℃恒溫孵育10 min；⑧HRP標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃恒溫孵育10 min；⑨新鮮配制的DAB顯色液顯色3～5 min。冷凍切片的免疫組織化學(xué)步驟略去①和②，石蠟切片的免疫組織化學(xué)步驟略去③，其余與試劑盒說明書推薦步驟相同。用已知RAGE陽性的乳腺癌切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗用作為陰性對(duì)照。

3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)后的免疫組織化學(xué)切片用K-Viewer圖像掃描儀掃描，選取陽性部位輸出圖片，用Image-Pro plus 6.0分析每例標(biāo)本的石蠟、冷凍切片中陽性表達(dá)的RAGE和Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度，即光密度值[6]，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用independent-samples t test和χ2檢驗(yàn)分析，所有數(shù)據(jù)資料均用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以α=0.05（2-tailed）為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié)果

RAGE和Ki-67在乳腺癌石蠟切片中均呈陽性表達(dá)，分別定位在胞質(zhì)和胞核（圖1A、B）；二者在乳腺葉狀腫瘤中也有表達(dá)，主要在上皮表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較低（圖1C、D）；此外，RAGE和Ki-67在乳腺癌癌旁組織中的炎性細(xì)胞里有少量表達(dá)（圖1E、F）；陰性對(duì)照切片中兩種蛋白免疫組織化學(xué)染色均為陰性（圖1G、H）。在冷凍切片中，RAGE和Ki-67免疫反應(yīng)產(chǎn)物常定位不清（圖1LM）；二者的陽性表達(dá)率分別為53.33%（8/15）和66.67%（10/15），明顯低于在石蠟切片中的陽性表達(dá)率（100%, 15/15和100%，15/15）（P＜0.05）；此外，兩種蛋白石蠟切片中的表達(dá)強(qiáng)度也明顯要強(qiáng)于在冷凍切片中的表達(dá)強(qiáng)度（圖1N；P＜0.01）。

圖1 RAGE和Ki-67在乳腺腫瘤石蠟切片和冷凍切片中免疫組織化學(xué)染色比較。A和B，乳腺癌石蠟切片中RAGE和Ki-67免疫組織化學(xué)染色；C和D，乳腺葉狀腫瘤石蠟切片中RAGE和Ki-67免疫組織化學(xué)染色；E和F，乳腺癌癌旁組織的炎性細(xì)胞中RAGE和Ki-67免疫組織化學(xué)染色；G和H，RAGE和Ki67在陰性對(duì)照切片中呈陰性；J和K，乳腺腫瘤冷凍切片中RAGE和Ki-67免疫組織化學(xué)染色；L和M，乳腺腫瘤冷凍切片中RAGE和Ki-67免疫組織化學(xué)染色，陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物定位模糊；N，乳腺腫瘤冷凍切片和石蠟切片中RAGE和Ki-67免疫反應(yīng)性比較；比例尺，100 μm； **P＜0.01，n=15 Fig. 1 Comparison of immunohistochemical staining of RAGE and Ki-67 in paraffin sections and frozen sections of breast tumors. A and B, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in paraffin sections of breast cancer tissues; C and D, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in paraffin sections of lobar breast tumor; E and F, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in the inflammatory cells of the adjacent tissues of breast cancer; G and H, negative immunohistochemical staining of RAGE and Ki-67 in the negative control sections; J and K, RAGE- and Ki-67-immunohistochemical staining in the frozen sections of breast cancer; L and M, fuzzy localization of RAGE- and Ki-67-immunoreactive products in frozen sections of breast tumor; N, comparison of RAGE- and Ki-67-immunoreactivities in frozen and paraffin sections of breast tumors; scale bar, 100 μm; **P＜0.01, n=15

討論

免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用抗原抗體特異性反應(yīng)發(fā)展起來的一項(xiàng)染色技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，對(duì)判斷腫瘤的來源、分類、指導(dǎo)臨床用藥等有著重要的作用[7]。在臨床和科研活動(dòng)中，可以選用石蠟或冷凍切片來進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，但影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素非常多。近年來，使用冷凍切片做術(shù)中快速免疫組織化學(xué)染色來協(xié)助診斷的例子越來越多，而冷凍切片做免疫組織化學(xué)的結(jié)果和穩(wěn)定性仍需要進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)使用了兩個(gè)在乳腺腫瘤組織中表達(dá)比較普遍的胞質(zhì)蛋白R(shí)AGE和胞核蛋白Ki-67作為研究對(duì)象，分析其在石蠟和冷凍切片中的差異表達(dá)情況，進(jìn)一步探索冷凍切片用于免疫組織化學(xué)檢測的適用條件和應(yīng)用價(jià)值。

高級(jí)糖基化終末受體RAGE在多種腫瘤組織中表達(dá)升高，其在乳腺癌腫瘤組織中的mRNA和蛋白均表達(dá)升高[2]。Ki-67是反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)，處于增殖期的腫瘤細(xì)胞越多，表達(dá)越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，RAGE和Ki-67蛋白在所有待測乳腺腫瘤石蠟切片標(biāo)本中的表達(dá)均顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；我們還觀察到，乳腺癌癌旁組織中的炎癥細(xì)胞里也有少量RAGE和Ki-67的表達(dá)，可能與機(jī)體對(duì)腫瘤的炎性反應(yīng)有關(guān)。

在本研究中，我們使用了現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)冷凍切片免疫組織化學(xué)有利的各種實(shí)驗(yàn)條件。冷凍切片免疫組織化學(xué)染色常用的固定液有：95%乙醇、AAF固定液，EAF固定液和冷丙酮等，本次實(shí)驗(yàn)中使用了文獻(xiàn)報(bào)道固定效果較好的EAF固定液，但染色效果不佳。因此，對(duì)于冷凍切片的每一種組織或不同抗原所適用的固定液不同，需要反復(fù)測試后選用最佳的，與此前文獻(xiàn)的結(jié)論一致[1]。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，新鮮組織標(biāo)本中含有大量的內(nèi)源性過氧化物酶，使用3% H2O2和山羊血清封閉仍有必要，對(duì)減輕染色背景意義重大。關(guān)于胞膜通透劑的使用上，文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，本研究在冷凍切片的預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶前一步驟使用了0.3% Triton X-100，獲得了較好的效果，因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中均使用了胞膜通透劑。一抗與待測抗原的親和力也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素，在一些商品化的快速冷凍免疫組織化學(xué)試劑盒中，使用了葡聚糖和辣根酶共同標(biāo)記一抗的技術(shù)，既提高了親和力又縮短了實(shí)驗(yàn)過程，顯示出良好的染色效果和穩(wěn)定性[7-9]，但這種情況主要表現(xiàn)在臨床病理診斷的常見指標(biāo)蛋白的檢測上，對(duì)于常規(guī)一抗的冷凍免疫組織化學(xué)染色則不太理想。本研究中使用了SP法，一抗的孵育條件設(shè)置為37 ℃ 和1 h，在石蠟切片上得到了良好的染色效果；適當(dāng)增加孵育溫度有助于抗原和抗體的結(jié)合，在自動(dòng)化的免疫組織化學(xué)染色機(jī)中，也利用了相同的設(shè)置，以便快速得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。RAGE和Ki-67在冷凍切片中的表達(dá)率（55.33%，66.67%）和表達(dá)強(qiáng)度與石蠟切片相比均較低，兩者在冷凍切片中的染色還存在抗原彌散，定位不準(zhǔn)確，甚至假陰性的現(xiàn)象。兩種蛋白的冷凍切片顯色不佳，作者認(rèn)為不在SP法本身，可能是切片的處理方法[8-10]和乳腺腫瘤組織本身的特異性等綜合因素造成了以上的差異。

比較蛋白表達(dá)強(qiáng)度在以往的研究中一般使用評(píng)分法，在本研究中，作者使用了一款圖像分析軟件來對(duì)免疫組織化學(xué)切片染色強(qiáng)度進(jìn)行精確的定量[6]，這樣既可以發(fā)現(xiàn)染色細(xì)微的變化，也減少了人為判讀造成的主觀因素帶來的影響。

綜上所述，盡管在保存抗原上有眾多優(yōu)勢，但受處理方式和實(shí)驗(yàn)條件的影響，使用冷凍切片做科學(xué)研究或臨床上開展新的抗原免疫組化檢測項(xiàng)目時(shí)，需要更加的慎重，應(yīng)該有多次的預(yù)實(shí)驗(yàn)證據(jù)和穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果后才可以廣泛的推廣應(yīng)用。