米紀(jì)聰，黃鴻斌，吳煜，陳嫻嫻，張盛周

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000）

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，人類增加了對(duì)重金屬資源的開發(fā)和利用，大量重金屬隨著工業(yè)廢水流入水體中給不少水環(huán)境造成污染[1]。由于水生生物與水體的密切接觸，水體中的重金屬很容易通過進(jìn)食、皮膚吸收、隨血液循環(huán)進(jìn)入水生動(dòng)物的各個(gè)器官和組織[2]。重金屬一旦進(jìn)入水生生物體內(nèi)不易被代謝和排出，容易在生物體內(nèi)富集積累[3]。不斷積累的重金屬會(huì)對(duì)生物體各器官造成嚴(yán)重?fù)p傷，特別是呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)和生殖系統(tǒng)以及消化道[4]。目前對(duì)重金屬的生物毒性機(jī)理還不是很清楚，不少研究表明重金屬可影響生物體內(nèi)多種酶的活性對(duì)水生生物的正常生命活動(dòng)造成毒害[5]。

牛蛙（Rana catesbiana）隸屬于兩棲綱無尾目蛙科，是世界上最受歡迎的大型食用蛙，自1959年首次從古巴引進(jìn)中國以來深受廣大消費(fèi)者的喜愛，是我國主要的商業(yè)型水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物之一[6,7]。朱聯(lián)九等[8]研究了成體牛蛙消化液蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶在消化道的分布以及pH和溫度對(duì)這些酶活性的影響。韋金鑫等[9]研究了牛蛙消化道黏膜堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、腺苷三磷酸酶、酯酶和脂酶的分布。但重金屬對(duì)牛蛙消化道黏膜中酶活性的影響尚未見報(bào)道。本研究用不同濃度重金屬離子溶液處理組織，應(yīng)用酶組織化學(xué)方法檢測(cè)了Cd2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+等4種常見重金屬對(duì)牛蛙消化道黏膜過氧化物酶（peroxidase, POX）、非特異性酯酶（nonspecific esterase, NSE）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase, SDH）、酸性磷酸酶（acid phosphatase, ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase, ATPase）等6種酶活性的影響，旨在探討重金屬離子對(duì)牛蛙的毒理作用，為牛蛙的人工潔凈養(yǎng)殖和環(huán)境保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人工養(yǎng)殖成體牛蛙10只，重300～430 g，購自蕪湖市黃山西路菜市場(chǎng)。穿刺毀髓，解剖，迅速取出完整的消化道，分別在食道、胃賁門、胃體、胃幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸黏膜切取小塊組織。用磷酸緩沖液（PBS，pH7.4）快速洗凈，吸水紙輕輕吸干，OCT包埋，使用冰凍切片機(jī)于-26 ℃下切片，厚度為8 μm，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 重金屬溶液配置

分別稱取氯化鎘(CdCl2·2.5H2O) 0.228 g；無水硫酸銅(CuSO4) 0.25 g；氯化鎳(NiCl2·6H2O) 0.237 g；硝酸鉛Pb(NO?)? 0.331 g溶于5 mL去離子水配置成0.2 mol/L的Cd2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+母液，使用時(shí)稀釋成相應(yīng)的工作濃度。重金屬試劑均是國產(chǎn)分析純。

3 重金屬處理方法

選取酶在消化道8個(gè)部位中活性最高的部位進(jìn)行重金屬溶液處理。POX、NSE、ALP、ACP、ATPase設(shè)置0.2 mol/L、0.02 mol/L、0.002 mol/L 3種梯度的重金屬溶液進(jìn)行處理，由于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SDH相較于其它幾種酶對(duì)重金屬的影響更加敏感，SDH設(shè)置2×10-1～2×10-7mol/L 7種濃度梯度的重金屬溶液進(jìn)行處理，對(duì)照組采用0.7%生理鹽水進(jìn)行處理。將300 μL重金屬溶液滴加在冰凍切片組織上，室溫（25 ℃）孵育30 min后用去離子水洗去，吸水紙洗去剩余水后用酶組織化學(xué)方法染色。

4 酶組織化學(xué)方法

牛蛙消化道6種酶的組織化學(xué)染色方法和主要底物見表1。 實(shí)驗(yàn)試劑的全名、詳細(xì)配制方法及具體操作步驟參見文獻(xiàn)[10]。

表1 6種酶的組織化學(xué)染色方法和主要底物Tab. 1 Histochemical staining techniques and main substrates of the six investigated enzymes

5 光密度測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Olympus BX61型號(hào)顯微鏡，在40倍物鏡視野下，觀察切片并拍照記錄。采用Image-ProPlus圖像分析軟件，對(duì)酶組織化學(xué)染色陽性部位進(jìn)行光密度分析，測(cè)算得到照片中陽性部位的累積光密度（intergrated optical density, IOD)和面積（area），算出平均光密度（mean optical density, MOD），以平均光密度值表示消化道各部位酶活性的強(qiáng)弱；采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)各種酶的活性變化進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

結(jié)果

1 高濃度Cd2+、Ni2+和Cu2+抑制POX活性

POX的酶組織化學(xué)陽性顯色結(jié)果為棕黃色和黃色。POX在消化道各段均有分布，其中在直腸酶活性最高。POX在消化道黏膜上皮中分布最多，在固有層中也有少量分布，其反應(yīng)物呈現(xiàn)顆粒狀分布（圖1左）。Cd2+和Ni2+在0.2 mol/L濃度時(shí)對(duì)POX的活性有相似的抑制效應(yīng)，其抑制程度要強(qiáng)于0.2 mol/L的Cu2+；這3種重金屬在0.02 mol/L和0.002 mol/L濃度時(shí)對(duì)POX活性無顯著影響；Pb2+則在3種濃度下對(duì)其活性均無顯著影響（圖1左，圖3A）。

圖1 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+對(duì)POX、NSE、SDH活性影響的組織化學(xué)檢測(cè)。L，消化道腔；LP，固有層；ME，黏膜上皮；FG，胃底腺體；SB，紋狀緣；比例尺，50 μmFig. 1 Histochemical examination for the effects of Cd2+, Cu2+, Ni2+ and Pb2+ on the activities of POX, NSE and SDH. L, digestive tract lumen; LP, lamina propria; ME, mucosal epithelium; FG, fundus gland; SB, striated border; scale bar, 50 μm

2 Ni2+和Pb2+抑制NSE活性

NSE的酶組織化學(xué)陽性顯色結(jié)果為棕紅色。其在消化道各段均有較高活性，其活性在十二指腸部位最高。NSE在十二指腸中主要分布于黏膜上皮中且活性在紋狀緣處最高，在固有層中也有一定量的分布（圖1中）。 Cd2+和Cu2+在3種濃度下均對(duì)NSE的活性無顯著影響，而Ni2+在0.2 mol/L時(shí)對(duì)NSE的活性有顯著的抑制作用，Pb2+則在0.2 mol/L和0.02 mol/L兩種濃度下對(duì)NSE活性有顯著的抑制作用（圖3B）。

3 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+均能抑制SDH活性

SDH的酶組織化學(xué)陽性顯色結(jié)果為藍(lán)紫色。其在消化道各段均有分布，胃體中活性顯著較高。SDH在胃部主要分布于胃底腺處(圖1右)。SDH對(duì)重金屬的敏感度遠(yuǎn)高于其它5種酶。Cd2+和Cu2+對(duì)SDH的活性有著相似的抑制作用，均在2×10-1mol/L到2×10-4mol/L范圍內(nèi)完全抑制其活性，在2×10-5mol/L也有顯著的抑制作用。Pb2+對(duì)SDH活性的抑制作用要弱于Cd2+和Cu2+，其在2×10-1mol/L到2×10-3mol/L范圍內(nèi)完全抑制其活性，在2×10-4mol/L濃度下顯著抑制其活性。Ni2+相對(duì)其它3種重金屬，對(duì)SDH活性抑效應(yīng)最弱，只在2×10-1mol/L濃度下完全抑制，在2×10-2mol/L到2×10-3mol/L范圍內(nèi)顯著抑制其活性（圖3C）。

4 高濃度Cu2+和Pb2+抑制ACP活性

ACP的酶組織化學(xué)陽性顯色結(jié)果為棕黃色。ACP在消化道各段均有分布，在胃幽門處活性最高。ACP在消化道中主要分布在粘膜上皮中，在固有層中也有少量的分布（圖2左）。Cd2+和Ni2+在3種濃度條件下均對(duì)ACP的活性無顯著影響。Cu2+和Pb2+僅在0.2 mol/L時(shí)對(duì)ACP的活性存在顯著抑制作用，且Cu2+的抑制效應(yīng)要強(qiáng)于Pb2+（圖3D）。

圖2 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+對(duì)ACP、ALP、ATPase活性影響的組織化學(xué)檢測(cè)。L，消化道腔；LP，固有層；ME，黏膜上皮；SB，紋狀緣；比例尺，50 μmFig. 2 Histochemical examination for the effects of Cd2+, Cu2+, Ni2+ and Pb2+ on the activities of ACP, ALP and ATPase. L, lumen of the digestive tract; LP, lamina propria; ME, mucosal epithelium; SB, striated border; scale bar, 50 μm

圖3 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+對(duì)酶活性影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 A ，POX；B，NSE；C，SDH；D， ACP；E，ALP；F， ATPase。與對(duì)照組比較，** P＜0.01Fig. 3 Statistical analysis for the effects of Cd2+, Cu2+, Ni2+ and Pb2+ on the enzyme activities. A, POX; B, NSE; C, SDH; D, ACP; E, ALP; F, ATPase. ** P ＜ 0.01, compared with control group

5 Cu2+和Pb2+抑制ALP活性

ALP的酶組織化學(xué)陽性顯色結(jié)果為藍(lán)紫色。ALP在十二指腸處活性最高。ALP在消化道中主要分布于粘膜上皮，且在紋狀緣處呈現(xiàn)出較高的活性（圖2中）。Cd2+和Ni2+對(duì)ALP的活性在3種濃度下均無顯著抑制作用。Cu2+在0.2 mol/L濃度下對(duì)其活性有著較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，在0.02 mol/L和0.002 mol/L時(shí)也有一定程度的抑制情況。Pb2+在0.2 mol/L時(shí)完全抑制其活性，在0.02 mol/L和0.002 mol/L時(shí)則無顯著影響（圖3E）。

6 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+均能抑制ATPase活性

ATPase的酶組織化學(xué)顯色結(jié)果為棕黑色。ATPase在消化道各段均有較高的活性，在空腸處活性最高。ATPase在消化道中的分布類似于ALP，也是主要分布于黏膜上皮，從基底部往紋狀緣處活性逐漸升高（圖2右）。4種重金屬對(duì)ATPase的活性均有抑制作用，Cd2+在0.2 mol/L和0.02 mol/L濃度下對(duì)其活性有顯著的抑制作用，隨著濃度下降抑制效應(yīng)有所降低。Cd2+、Cu2+和Pb2+對(duì)酶活性的影響類似，在0.2 mol/L時(shí)的抑制效應(yīng)強(qiáng)于0.02 mol/L，在0.002 mol/L時(shí)則對(duì)ATPase活性無顯著影響。Ni2+在3種濃度下對(duì)ATPase均有顯著的抑制作用，且抑制程度相同（圖3F）。

討論

POX通常存在于過氧化物酶體中，其可催化過氧化氫分解、氧化酚類和胺類化合物將有害物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)從而保護(hù)細(xì)胞免受毒害[11]，并在水生生物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用[12]。Cd2+對(duì)家蠶POX活性的影響存在時(shí)間劑量效應(yīng)，在短時(shí)間低濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)其活性，而在高濃度長時(shí)間情況下則會(huì)抑制其活性[13]。Cu2+在濃度小于50 mg/L時(shí)對(duì)紅樹植物幼苗POX活性有促進(jìn)作用，而在75 mg/L時(shí)表現(xiàn)出一定程度抑制作用[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，使用重金屬體外處理POX，在低濃度時(shí)Cd2+、Cu2+、Ni2+對(duì)POX活性無顯著影響，在高濃度時(shí)會(huì)顯著抑制其活性，不同濃度的Pb2+對(duì)POX活性均無顯著影響。表明Cd2+、Cu2+、Ni2+污染會(huì)抑制牛蛙的解毒能力。

NSE存在于包括魚類在內(nèi)的大多數(shù)脊椎動(dòng)物中，NSE參與脂肪酸甘油酯的消化[15]。NSE在細(xì)胞內(nèi)毒素和小分子的加工和抗原提呈中起著至關(guān)重要的作用[16]。郭慧等[17]的研究表明在離體條件下Cd2+和Cu2+在濃度為10-4mol/L 和 10-3mol/L 時(shí)均會(huì)使羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）血細(xì)胞活性和酯酶活性均顯著下降。在濃度為0.1 mg/L Pb2+的脅迫下，櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血清和血細(xì)胞中的酯酶活性均顯著下降[18]。而本研究中Cd2+和Cu2+在3種濃度下均對(duì)酯酶活性無顯著影響，但Pb2+和Ni2+可在高濃度時(shí)會(huì)抑制NSE的活性，可見重金屬對(duì)不同物種的酯酶影響存在一定差異。

SDH是一種氧化還原酶，它參與呼吸鏈中的電子傳遞，以及三羧酸循環(huán)中的琥珀酸分解代謝，其突變會(huì)導(dǎo)致多種疾病[19]。SDH在體內(nèi)一些能量代謝較高的部位有較多分布，有關(guān)重金屬對(duì)其活性影響的報(bào)道較少。單劑量氯化鎘的注射會(huì)顯著抑制大鼠睪丸中SDH的活性，并且老齡大鼠中的抑制作用要比年輕大鼠中更明顯[20]。本研究顯示SDH相較其它酶對(duì)重金屬更加敏感，Cd2+和Cu2+在2×10-1mol/L到2×10-4mol/L范圍內(nèi)完全抑制其活性，Ni2+和Pb2+在2×10-1mol/L到2×10-4mol/L顯著抑制其活性。表明重金屬污染可能會(huì)抑制牛蛙消化道的能量代謝過程而降低其消化吸收機(jī)能。SDH對(duì)重金屬如此敏感或許可以作為水體中重金屬污染的生物指示物。

ACP廣泛分布于低等和高等生物的所有生命系統(tǒng)中，是一種重要的溶酶體酶，在細(xì)胞胞內(nèi)消化中發(fā)揮著重要功能[16]。ALP被認(rèn)為與脂質(zhì)、葡萄糖、鈣和無機(jī)磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有關(guān)，常被看作是消化道吸收營養(yǎng)的一種標(biāo)志酶[21]。因此研究重金屬對(duì)ACP、ALP活性的影響有助于了解重金屬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)等的影響。研究表明隨著鎘濃度的升高鯽魚腸道和鰓的ACP、ALP酶活性都顯著下降[22], 鰓ALP活性隨著鉛濃度的升高而顯著減低[23]。在本實(shí)驗(yàn)中，Cd2+和Ni2+在高濃度和低濃度下對(duì)ACP和ALP的活性均無顯著影響，Cu2+和Pb2+在0.2 mol/L濃度下顯著抑制ACP和ALP的活性，因此長時(shí)間Cu2+和Pb2+的污染可能會(huì)降低牛蛙的消化吸收功能。

ATPase是一類將ATP催化水解為ADP和磷酸根離子的水解酶，其普遍存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上，主要通過水解ATP為物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量，維持細(xì)胞內(nèi)外的離子梯度差，保證各種代謝活動(dòng)的能量需要[24]。重金屬離子Cd2+和Pb2+在低濃度條件下會(huì)對(duì)泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）的ATPase活性有誘導(dǎo)作用，而在高濃度條件下產(chǎn)生抑制作用[25]。本實(shí)驗(yàn)中4種重金屬在高濃度均顯著抑制ATPase的活性，進(jìn)一步表明重金屬的污染會(huì)通過抑制牛蛙的能量代謝而降低其消化吸收功能。

總之，本研究采用酶組織化學(xué)染色法首次檢測(cè)了四種常見重金屬對(duì)牛蛙消化道黏膜重要酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同重金屬對(duì)牛蛙消化道黏膜酶活性存在著不同的抑制作用。其中SDH對(duì)重金屬的影響最為敏感，四種重金屬對(duì)其活性均有較強(qiáng)程度的抑制作用。同時(shí)四種重金屬對(duì)ATPase的活性也都存在著不同程度的抑制作用，表明重金屬離子會(huì)通過抑制牛蛙能量代謝的過程影響其消化吸收功能。