李湘波 田 睿 賀小儉

長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院 (湖南 長(zhǎng)沙， 410015)

原發(fā)性肝癌(PHC)是一種易轉(zhuǎn)移、侵襲性高且具有較高發(fā)病率的惡性腫瘤，死亡率是全球惡性腫瘤死亡率第2位，僅次于肺癌[1]。PHC有著較高的復(fù)發(fā)率，手術(shù)后5年復(fù)發(fā)率為60%左右[2]。尋找一種能夠抑制PHC發(fā)生和發(fā)展的藥物是PHC治療的一個(gè)重要方向[3]。七葉皂苷鈉提取于中藥婆羅子，能夠糾正腦功能失常、保護(hù)血管、抗氧化和抗炎，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[4]。有研究表明七葉皂苷鈉能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖[5]，但對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和黏附能力的作用還有待研究，本研究應(yīng)用七葉皂苷干預(yù)HepG2肝癌細(xì)胞，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、黏附能力的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 七葉皂苷鈉購(gòu)自ChemFaces；瓊脂粉由北京索萊寶有限公司提供；DMEM高糖培養(yǎng)基由HyClone公司提供；胎牛血清(FBS)由Gibco公司提供；HepG2人肝癌細(xì)胞購(gòu)自大連美倫生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10% FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞緩慢聚集實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，分別加入低濃度(20 μmol/L)、中濃度(40 μmol/L)、高濃度(60 μmol/L)七葉皂苷鈉，孵育48 h后消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至鋪有瓊脂的96孔板中，每組重復(fù)5孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12 h，觀察細(xì)胞聚集情況并拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞團(tuán)數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，分別加入低濃度(20 μmol/L)、中濃度(40 μmol/L)、高濃度(60 μmol/L)七葉皂苷鈉，孵育48 h后消化細(xì)胞并且轉(zhuǎn)移至48孔板中，每組重復(fù)10孔，細(xì)胞長(zhǎng)滿后分別用含1 mmol/L CaCl2的0.2%胰酶(TC)、含1 mmol/L EDTA的0.2%胰酶(TE)消化細(xì)胞，鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞團(tuán)數(shù)(N)和單個(gè)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞分散程度(NTC/NTE)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，分別加入20、40、60 μmol/L七葉皂苷鈉，孵育24 h后消化細(xì)胞并按大于109個(gè)/L密度接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞長(zhǎng)滿后用吸頭尖端在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS清洗2次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后鏡下觀察、拍照，采用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度。

1.2.5 Western blot方法檢測(cè)E-cadherin蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，分別加入20、40、60 μmol/L七葉皂苷鈉，孵育48 h后加入細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解40 min，12 000 rpm離心20 min，收集上清液，測(cè)定總蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的NC膜上，室溫下含5%脫脂奶粉的TBS封閉3 h，然后分別加入β-actin和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)一抗，放置于4℃搖床中過(guò)夜，PBS洗膜3次后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，PBS洗膜3次后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光，采集圖像并計(jì)算E-cadherin相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用例(%)表示，組間比較采用獨(dú)立卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞聚集能力的影響 對(duì)照組細(xì)胞團(tuán)塊體積小，數(shù)量多且疏松。隨著七葉皂苷鈉濃度的升高，細(xì)胞團(tuán)塊的體積有所增大，數(shù)量減少但致密度增加。經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)分析，低濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)數(shù)為24.19±2.94，中濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)數(shù)為13.93±3.18，高濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)數(shù)為2.14±1.01，均低于對(duì)照組細(xì)胞團(tuán)數(shù)(64.28±6.83，P<0.05)，且不同濃度實(shí)驗(yàn)組制劑細(xì)胞團(tuán)數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明隨著七葉皂苷鈉濃度的升高，HepG2細(xì)胞的聚集能力增強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

2.2 七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞黏附能力的影響 與對(duì)照組比較，應(yīng)用含1 mmol/L CaCl2的胰酶處理細(xì)胞后，不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形成的團(tuán)塊體積較大(P<0.05)，且細(xì)胞團(tuán)塊體積大小與藥物濃度成正比；應(yīng)用含1 mmol/L EDTA的胰酶處理細(xì)胞后，各組細(xì)胞均分散為單個(gè)細(xì)胞，且分散度相似(P>0.05)。鏡下計(jì)數(shù)并計(jì)算，低濃度實(shí)驗(yàn)組NTC/NTE為0.50±0.06，中濃度實(shí)驗(yàn)組NTC/NTE為0.35±0.03，高濃度實(shí)驗(yàn)組NTC/NTE為0.16±0.04，均小于對(duì)照組(0.90±0.09，P<0.05)，不同濃度實(shí)驗(yàn)組NTC/NTE隨藥物濃度升高而降低(P<0.05)，說(shuō)明HepG2細(xì)胞間黏附能力隨藥物濃度增加而增強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

2.3 七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕后各組細(xì)胞的劃痕寬度相似(P>0.05)，孵育24 h后對(duì)照組細(xì)胞劃痕寬度明顯縮小，不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕寬度均寬于對(duì)照組，且劃痕寬度隨藥物濃度升越高而增大(P<0.05)，說(shuō)明HepG2細(xì)胞的遷移能力因藥物作用而受限，遷移能力受限程度隨著藥物濃度升高而加重。見(jiàn)圖3。

2.4 七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.02、1.02±0.06、1.93±0.31，均顯著高于對(duì)照組(0.43±0.03，P<0.05)，且不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度升高而增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

七葉皂苷作為一種臨床上廣泛應(yīng)用的消炎祛腫的藥物，有研究顯示其能到抑制乳腺癌的發(fā)展和生長(zhǎng)，前期研究表明七葉皂苷鈉能夠作用于NK-kB信號(hào)通路從而對(duì)癌癥細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制[6]。前期研究曾表明七葉皂苷鈉對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制效果與臨床上常用的索拉菲尼相似，對(duì)肝癌細(xì)胞具有抑制增殖的作用[7]。但是其對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和粘附能力是否有影響還有待研究[8]。本研究便應(yīng)用不同濃度的七葉皂苷鈉對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和粘附的影響，為七葉皂苷鈉抑制肝癌轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)資料。

細(xì)胞行為的改變與腫瘤的發(fā)展和發(fā)生有著重要的關(guān)系[9,10]。前期研究表明，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和遷移的首要原因是腫瘤細(xì)胞間的黏附力下降，其中鈣黏蛋白作為一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，其對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞間的同質(zhì)黏附有著重要的作用[11,12]。但細(xì)胞內(nèi)的鈣依賴性跨膜糖蛋白失活時(shí)，腫瘤細(xì)胞即可能脫離原發(fā)病灶位置轉(zhuǎn)移到其它位置發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[13,14]。本項(xiàng)研究中應(yīng)用細(xì)胞分離試驗(yàn)和細(xì)胞緩慢聚集實(shí)驗(yàn)對(duì)七葉皂苷鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞間粘附力的影響進(jìn)行研究。其中細(xì)胞分離試驗(yàn)主要是考慮到細(xì)胞內(nèi)鈣依賴性跨膜糖蛋白對(duì)Ca2+存在明顯依賴性而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)應(yīng)用含有CaCl2和EDTA的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理[12,15]。其中Ca2+能夠與EDTA發(fā)生明顯的螯合作用，降低Ca2+濃度，從而對(duì)鈣依賴性跨膜糖蛋白所介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附作用進(jìn)行抑制，從而細(xì)胞連接出現(xiàn)破壞，從而分散為單個(gè)細(xì)胞[16]。當(dāng)應(yīng)用含有Ca2+的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后，大量的Ca2+能夠促使鈣依賴性跨膜糖蛋白的黏附力正常發(fā)揮，細(xì)胞間的黏附力增大，細(xì)胞聚集形成團(tuán)塊[17]。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，鈣依賴性跨膜糖蛋白的功能越強(qiáng)，細(xì)胞黏附能力越強(qiáng)，容易聚集形成團(tuán)塊[18]。NTC/NTE被用于對(duì)鈣依賴性跨膜糖蛋白的功能進(jìn)行檢驗(yàn)，NTC/NTE的值越大，鈣依賴性跨膜糖蛋白的功能越弱，從而細(xì)胞間的黏附能力越弱。細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)是通過(guò)在培養(yǎng)皿中加入瓊脂從而對(duì)細(xì)胞懸浮的狀態(tài)進(jìn)行模擬，從而判斷懸浮細(xì)胞聚集成團(tuán)情況，通過(guò)對(duì)細(xì)胞聚集成團(tuán)的數(shù)量和大小對(duì)細(xì)胞間粘附力的大小進(jìn)行判斷[19]。細(xì)胞粘附力越弱，細(xì)胞聚集成團(tuán)數(shù)量越少，細(xì)胞團(tuán)塊疏松且體積較小，當(dāng)細(xì)胞粘附力較強(qiáng)，則細(xì)胞成團(tuán)緊密體積較大且成團(tuán)數(shù)量多。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，本研究應(yīng)用七葉皂苷鈉干預(yù)后，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的聚集能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞分散能力、遷移能力則降低(P<0.05)，作用隨藥物濃度升高而增強(qiáng)，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)有關(guān)。研究結(jié)果提示，七葉皂苷鈉能夠增強(qiáng)HepG2人肝癌細(xì)胞的同質(zhì)黏附力，抑制腫瘤細(xì)胞遷移。